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1、实验实验十十 质质粒粒 DNA 的的转转化化课程名称：生物化学与分子生物学实验课课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：年级：2006 专业、层次：临床医学本科专业、层次：临床医学本科 授课教师：许成山授课教师：许成山职称：讲师职称：讲师 学时：学时：4 学时学时基本教材：自编基本教材：自编 生物化学与分子生物学实验指导生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：教学目的与要求：1、学习重组 DNA 转化的基本操作；2、巩固基因工程的有关知识，加深理解转化的定义；3、掌握提高转化效率的基本思路。大体内容与时间安排：大体内容与时间安排：1、质粒的定义及特点 5min2、质粒 DNA 转化的定
2、义及原理 10min3、质粒 DNA 转化的操作步骤及注意事项 10min4、学生做实验 120min教学方法：教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：教学重点、难点：重点：1、质粒的定义2、质粒 DNA 转化的定义及原理3、重组质粒转化工程菌的筛选难点：质粒 DNA 转化的原理2一、实验原理一、实验原理（一）质粒：（一）质粒：是存在于细菌染色体以外的小型环状双链 DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。（二）转化：（二）转化：是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞是不含限制性内切酶和甲基化酶的限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和去
3、甲基化酶。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞） 。（三）感受态细胞的制备原理：（三）感受态细胞的制备原理：04，CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中（本次实验是人 Bcl-2 重组质粒）的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。将细
4、菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。（四）重组质粒转化工程菌的筛选：（四）重组质粒转化工程菌的筛选：本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA。3二、操作步骤二、操作步骤（一）细菌感受态细胞的制备（一）细菌感受态细胞的制备将 DH5 菌种划线于
5、LB 琼脂板上，37培养过夜。挑取单菌落接种于5ml LB 培养基中，37振荡培养培养过夜。次日取菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养基的烧瓶中，37剧烈振荡培养至约 23h，待 A600值达到 0.30.4 时将烧瓶置于冰浴 1015min。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的 50ml 离心管中。4 000g，4离心 10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl2重悬菌体，置冰浴 30min。4 000g，4离心 10min，弃培养基。再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl2，轻轻重悬菌体，置 4冰箱 12
6、16h。 （已做好）（二）（二）DNA 重组子的转化大肠杆菌重组子的转化大肠杆菌 DH5本实验中的 DNA 重组子为人 Bcl-2 重组质粒。在无菌条件下按每管取100l 新鲜感受态 DH5 细菌置于无菌的 5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入人 Bcl-2 重组质粒(10ng)和消毒水(作阴性对照)各 5l，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min。42，热休克 90s，中途不要摇动离心管，每管加800l 无抗生素的 LB 培养基，于 37空气摇床中以 50 r/min 速度振摇45min，使细菌复苏。每管取 200l 加至含氨苄青霉素（Amp）的 LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂
7、布均匀，室温放置 20min，使液体吸收，然后 37倒置培养 1216h 至单菌落形成。三、注意事项三、注意事项1、感受态细胞很脆弱，因此制备感受态细胞时，动作一定要轻，禁止剧烈的振摇或吹打。2、制备感受态细胞时使用的离心管均应为朔料管，禁用离心管，否则转化效率降低 10 倍。3、感受态细胞置冰上 4冰箱过夜，可提高转化效率 46 倍。4、感受态细胞热休克时间要准确，中途不要摇动离心管。45、细菌铺板密度过高或培养时间过长，会使一些未转化（不含 Amp 抗性）的细菌也形成菌落；将氨苄青霉素的浓度提高至 100g/ml 可使情况有所改善，但不能彻底根治。四、思考题四、思考题转化实验中在含 Amp 的选择性培养基上出现菌落，但阴性对照也有菌落出现，这说明了什么？请分析其原因。小小 结结把体外重组的 DNA 引入受体细胞，使受体菌转化为重组 DNA 的双重抗药性的新的遗传特性，从中选择出重组转化子。本实验综合因素较多，难度较高，在基因工程中是克隆与克隆表达中一个很关键的实验手段。
