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1、国家标准以修改Marklund 方法和化学发光法测定食品中SOD 活性。前者SOD 最低的检测浓度为 1.17U/mL ,相当于 1.1*10-8mol/L ,方法灵敏,仪器廉价,易于推广;后者SOD 活性测定最低检出浓度为0.033U/mL, 灵敏度比前者提高约两个数量级。具有更加灵敏、快速和干扰少等优点,但是试剂比较贵。第一法修改的 Marklund 方法(一)定义: 25时抑制邻苯三酚紫阳花速率50%时所需要的SOD 量为一个活力单位。(二)原理:在碱性条件下,邻苯三酚会发生自氧化,可以根据SOD 抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD 活力。( 三) A液: pH 8.20 0.1mol/L
2、三 羟 甲基 氨基甲烷( Tris )盐 酸缓冲溶液(内含1mol/LEDTA-Na2) 。称取 1.2114g Tris 和 37.2mgEDTA-Na2溶于 62.4mL0.1mol/LHCl溶液中,用蒸馏水定容至100mL. B 液: 4. 5 mmol/I. 邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯三酚(A.R)56.7 mg 溶于少量10 mmol/I. 盐酸溶液,并定容至10D mL 。10mmol/L 盐酸溶液;0.200mg/mL 超氧化物歧化酶;蒸馏水;二重石英蒸馏水。(四)仪器设备紫外 -可见分光光度计;精密酸度计(精确度0.01pH);离心机; 10mL 比色管; 10mL 离心管;玻
3、璃乳钵。(五)试样的制备1、固体样品 (茶、花粉等 )称取 1.00 g 样品置于玻璃乳钵中,加入 9. 0 mI.蒸馏水研磨5 min, 移入 10mL 离心管。 用少量蒸馏水冲洗乳钵,洗涤并入离心管中,加蒸馏水至刻度,经 4000 r/min 离心 15min,取上清液测定。2、澄清液体样品可取原液直接测定,浑浊液体样品经4000r/min 离心 15min, 再取上清液测定。(六)分析步骤1、邻苯三酚自氧化速率测定再 25左右,于10mL 比色管中依次加入A 液 2.35mL,蒸馏水 2.00 mL, B 液 0.15 mL。加入 B 液立即混合并倾人比色皿,分别测定在325 nm 波长条件下初始时和1 min 后吸光值,二者之差即邻苯三酚自氧化速率?A325(min-1) 。本试验确定?A325(min-1)为 0.060 。2、 样液和 SOD 酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按1.步骤分别加人一定量样液或酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2?A325(min-1)即 ?A 325( min-1)为 0.030 SOD 活性测定加样程序见表1 。(七)结果1、结果计算液体样品按式(1)计算:2、固体样品按式(2)计算:2、精密度 再重复性条件下的两次测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。