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1、从动物组织中提取基因组DNA （一）实验目的通过实践操作与实验实践掌握从动物组织中提取DNA的基本原理和基本方法。( 二) 实验原理在 EDTA和 SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA ， 用此法得到的DNA长度为 100-150kb ， 适用于噬菌体构建基因组文库和DNA印迹分析。（三）试剂、材料、仪器与器材1. 试剂与材料1)Tris HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法：40ml 双蒸水， 6.057g 固体 Tris放入烧杯中溶解， 用浓盐酸调PH值到 8.0 ， 转移到 50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备
2、好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温， 4保存备用。2)生理盐水 : 0.85%NaCL 100ml 配制方法：在 20ml 双蒸水中溶解0.85g 固体 NaCL ，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。3)EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法：将 9.08g 的 EDTA Na22H2O溶解于 40ml 双蒸水， 用 1g 的 NaOH 颗粒（慢慢逐步加入）调 PH 值到8.0 ，用50ml 容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA Na2 2H2O 。4)TES缓冲液（释放D
3、NA ） 100ml 配制方法：将 0.5844g 的 5 mol/lNaCl溶解于 80ml 双蒸水，在分别加入1ml 的 0.5 mol/l EDTA、0.2ml的 Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。5)10% SDS （变性剂破细胞壁） 100ml 配制方法：将 10g 的十二烷基硫酸钠（SDS ）溶解于80ml 双蒸水于68加热溶解，用浓HCl 调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4保存备用。6)蛋白酶 K（降解蛋白质） ：20mg/mL 无菌三蒸水
4、溶解。7)RNA酶 （降解 RNA ） （选配）配制方法：将胰 RNA酶（ RNA酶 A）溶于 10mmol/L 的 Tris CL （PH7.5） 、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml 的浓度，于100加热 15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于20。8)氯仿：异戊醇 =24：1 100ml 按 24:1 的比例加入氯仿、异戊醇， 摇匀， 转到准备好的瓶中，贴上标签， 4保存备用。9)TE缓冲液（溶解DNA ） PH8.0 50ml 配制方法：将 0.5ml 的 10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml 的 0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到
5、50ml的容量瓶中，调PH8.0 定容至 50ml 摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温， 4保存备用。2. 仪器与器材移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴箱。（四）操作步骤1.组织块解冻， 取适量组织于PBS溶液中清洗干净后放入装有500 微升 PBS的离心管中（ 1.5ml ） ，用剪刀剪碎；12000rpm 离心 8min，取出弃上清；2.加入 0.45ml TES 混匀，再加入50ul SDS（10% ） ， 20ul 蛋白酶 K（20mg/ml） ，充分混匀后，于56保温 4-6h ，每 2h 摇 1次 , 至体系透亮为好。3.放置到室温，加入等体积饱和酚
6、（500ul ） ，上下温柔翻转5min,12000r/m ，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml 离心管。4.加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24： 1） ，上下温柔翻转5min，12000r/m ，离心 10 分钟，取上层转移到新的1.5ml 离心管中。5.加入等体积氯仿：异戊醇 （24：1） ，上下温柔翻转5min，10000r/m ，离心 10 分钟，取上层清液到一个新的1.5ml 离心管。6.加入 1/10 体积的 NaAc （4保存）， 加入 2 倍体积的 -20 预冷的无水乙醇沉淀DNA ，置于 -20 中保存30min 或更久；观察
7、现象。7.12000 r/m ，离心 10 分钟，弃乙醇。8.-20 保存的 75% 乙醇洗涤， 12000 r/m ，离心 5 分钟，去乙醇，55干燥 DNA 。9.加入适量TE溶解 DNA （具体依DNA的多少而定） （一般 50L） ，-20 保存备用。如果除去其中的RNA ，可加 5l RNaseA(10g/ l),37保温 30min，用苯酚抽提后，按步骤9 和 10 重沉淀 DNA 。（五）注意事项1.要充分除去DNA提取液中的苯酚，否则会影响以后的操作。2.用酚 - 氯仿 - 异戊醇（体积比为25：24：1）抽提后取上清是不能将中间的蛋白质扰动，以防蛋白质污染。3.酚- 氯仿 - 异戊醇中的异戊醇是用来消除实验中可能产生的泡沫。4.抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。5.取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。6.乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA 。7.离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。
