《双向荧光原位杂交手册(2_dimension-fish_protocol)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双向荧光原位杂交手册(2_dimension-fish_protocol)（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、组织（细胞）间期核组织（细胞）间期核 2-dimension DNA FISH 实验步骤实验步骤 Note：依照本 protocol 进行该实验两大关键因素： 一是样品玻片的制备样品玻片的制备，包括细胞核释放的多少，点片的细胞密度，玻片背景的干净 与否，溶液的新鲜程度，蛋白酶消化的时间等； 二是 BAC 探针的制备纯化探针的制备纯化，包括 BAC 的纯度，探针的质量，不同探针的比例，与 样品孵育的时间等；另外，温度，湿度，光照也要严格按要求进行。一、组织间期核制备过程一、组织间期核制备过程 1组织放入平皿中，加含 50ul 双抗的 PBS 5ml 泡 10min。 2用 PBS 洗一下，剪碎。
2、 3加胶原酶 5ul 和培养液 5ml 放入 37 度过夜。 （该步骤只针对不易释放游离细 胞的组织） 过夜消化则以上操作均需在超净台进行，以防污染 （细胞：PBS 洗两遍，消化细胞，收集，PBS 洗一遍，细胞数太少则不洗） 。 4. 将组织碎块（细胞）在 15ml 离心管中加 0.075M KCL 10ml，37 水浴锅 内低渗 30min。 5. 取出加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2-3 滴混匀，室温 1000rpm 离心 10min 弃上清。 6. 加固定液 10ml 混匀后，室温静置 30min，离心弃上清。 7. 步骤 6 重复三次后加入固定液 1.5ml，混匀后静置 12min，
3、将上层较为清亮 的细胞悬液约 1ml 转于 1.5 ml EP 管内 4存放。 （长期可置-20冻存） 8.点片：将适当细胞密度的悬液 0.2-1l 点于玻片上，用钻石笔在玻片背面划 出范围，室温过夜。二、荧光探针的标记（随机引物）二、荧光探针的标记（随机引物） 1. 预变性( PCR 仪) template DNA (ds DNA) 200ng 2.5 x Kenelow buffer (invitrogen) 10l ddH2O - 12.5l95 10min2. 取出 PCR 管, 立即放冰上 12 min 3. 室温加缺 T 的 dNTP (A/C/G : T= 0.5 : 0.25)
4、, 各管加 4l 4. 快速各加 8l 所要标记的荧光素(eg.Cy3-dUTP)，马上避光 5. 再各加 0.5lKenelow 酶，混匀后轻微离心一下（甩一下即可） ，37避光过 夜（16 小时以上） ，此时 PCR 管内溶液的总体积为 25l。6.第二天加 2.5l stop buffer 混匀，瞬时离心后 4 避光存放。三、三、Fluorescence in situ hybridization (直接标记直接标记) 注意：73水浴锅应在实验前开始调温度开关键，立式染缸应在 40前 放入水浴锅，否则易使染缸破裂。（一）（一） 、前期处理、前期处理 玻片的处理玻片的处理1.10g/l R
5、Nase1.0 l 现配 1：100 溶于 2 X SSC 99 l, 37 消化 40min (将2 X SSC 加到 PCR 管中再将 RNase 加到 2 X SSC 中，混匀，用移液枪将混 匀的液体吸起再加到载玻片的染色体上，再剪下 PE 手套，展开成适当大小 的薄膜覆盖在印迹上，避免液体蒸发，放 37的湿盒中 40min)。 2.2 X SSC 3min X 2 (揭开薄膜将玻片放在 2 X SSC 的染缸 A 中，3 min 后取 出将玻片下沿挂的液珠放在几层的卫生纸上吸干，再放在 2 X SSC 染缸 B 中 3min) 3.取出，再按照上述的方法吸干液珠，依次放入 75%、85
6、%、100%的乙醇 2min X 3 次，晾干 4.蛋白酶消化: 吸取 60l 1 X Pepsin (现配 0.01N HCl:1% pepsin=200:1) 加到 玻片的印迹上，用 PE 做成的薄膜覆盖在上面，37温箱中放 1520min (在 加 pepsin 前，先要混匀, 消化时间应根据不同样品的通透性和探针的种类 做预实验而定)。 5.1 X PBS，5min 6.固定 (取出玻片，放入 1%的多聚甲醛的立式染缸里，10min) 7.1 X PBS，5 min 8.脱水 (三次 75%、85%、100%乙醇脱水 2min x 3 次)，晾干 9.70%FA 变性，73，2-3mi
7、n 10. 取出，放入预冷的 2 X SSC，3min X 2 11. 然后，梯度乙醇脱水 (75%、85%、100%) 2 min X 3，晾干 探针的处理探针的处理 标有荧光的探针V1= Va+Vb Cot-1 (封闭中度重复序列)V2= (1-2 倍 V1 ) SS DNA(封闭高度重复序列)V5=1/10 (V1+V2+V5+V6)5lddH2OV6=50l -(V1+V2+V5)V1+V2+V5+V650lNaAc (3mol/l) (沉淀探针)V3=1/10 (V1+V2+V5+V6)5l100%乙醇 (-20)V4=2 X (V1+V2+V3+V5+V6)110l1在 PCR 管
8、内混匀 (以上混合液放在纸盒内，不停的转动，以使混合液混匀) 出现白色沉淀2-80，30min-12h注意：有时还需加鲑鱼精 (SS DNA)： 5l (封闭高度重复序列， 13、14、15、21、22 号染色体有随体 DNA 即有高度重复序列) 312000rpm，4，10min，去上清 4加适量的-20预冷 75%乙醇，12000rpm，4， 5min 注：这次要用 TIP 头在管壁划几圈，目的使粘附在管壁上的探针溶在溶液 中 5去上清，在暗处晾干 6配杂交液（50%杂交液适用于所有含 BAC 模板的探针，60%杂交液适用于 只含着丝粒模板的探针） ，也可预先配好置于-20 7将适量的杂交
9、液（一般为 5-10l，视杂交印记大小而定）加入晾干的探针里， 于 PCR 仪中 37 30min，75 8min，37 35min 可延长(预复性 37 30 min 封闭非特异性位点如 Cot1-DNA 或鲑鱼精)。 8将探针加到玻片上，将盖玻片盖在上面，要注意防止气泡的产生还要保证盖 住整个染色体，再取一个已剪部分的 Tip 头，吸取适当量的树脂沿着盖玻片 封住缺口，防止液体挥发掉, 待树脂干后放在 37湿盒内，要放置 24h 以上， 探针模板中含 BAC 时需放置 48h 以上待用。（二）（二） 、杂交后处理、杂交后处理 （此后均要注意避光，以防荧光探针淬灭）（此后均要注意避光，以防荧
10、光探针淬灭） 1. 从 37的湿盒中取出玻片，用小镊子夹走盖玻片周边的封胶。 2. 50%FA，43水浴，15min，每隔 3 分钟晃动几下 (目的是除去背景杂交)。 3. 将 2 X SSC/0.1%NP40 两个染缸和盛有 2 X SSC 的两个染缸放在摇床上，将 摇床上的控制面板的 SPEED 指数调到 2.5，然后按照顺序依次将玻片放入四 个染缸内 3min X 4 次，顺序为 2 X SSC/0.1%NP40、2 X SSC/0.1%NP40、2 X SSC、2 X SSC (取出玻片，每次要将下沿挂的液珠吸干)。若操作有难度， 可只做玻片放于 2 X SSC，3min X 2，间隔
11、多晃动几次，无需在摇床上洗。 4. 取出玻片，脱水 (依次 75%、85%、100%乙醇) 2min X 3 次，取出，晾干。 (一定要在暗处晾干，因为玻片上已经有标有荧光探针，以免荧光淬灭) 5.加 7.5l DAPI 到玻片上，然后将一大的盖玻片盖上，同样要避免气泡的产 生 (盖玻片一定要事先在乙醇中浸泡过的，取出来，晾干再用)，然后将玻 片放在暗室里，作用 20min 后即可观察。（三）（三） 、看片、看片 1从暗室里取出玻片，然后依次按顺时针打开五个仪器开关，并打开电脑上 MetaMorph 软件，在软件的界面里打开 Acquire 这个模块。 2打开荧光显微镜的电源开关，把玻片放在载
12、物台上，要将有细胞核的一面 朝上，并且毛面朝右 3滴 1 滴 IMMERSION OIL，将 63 X 的油镜对准滴油的部位。拉开光栅钮， 转动光通道至看 DAPI 显色的位置，盖上头罩，在暗处调视野，直至找到 细胞核 (由于用的是激发光，只有在暗处才能找到视野)。 4记下载物台的坐标，拉开下面一个拉杆，在 Acquire 模块里选择 EXPOSURE TIME：0.02sec，得到细胞核的影像。保持玻片的位置不变， 选择所标记荧光对应的通道，改变曝光时间（如 FITC,Cy3 为 25sec） ，拍照。 5选择软件里的 Display 模块，点击其中的 Combine color 选项, 赋
13、予不同的 荧光图像不同的颜色，然后合成一张完整的图片存档。试剂和溶液试剂和溶液： 试剂： 1.Human cot 1-DNA, Gibco ; ssDNA, Sigma 2.Cy3-dUTP, FITC-dUTP, etc, Biosciences 3.DAPI: FluoroPure grade, Invitrogen 溶液： 1.20X SSC: 175.3g NaCl, 88.2g 柠檬酸钠，用 10 mol/L NaOH 调至 pH 7.0, 加 H2O 定容 至 1L2.1X pepsin: 10% pepsin 0.5l, 0.01N HCl 1ml3.40% 硫酸葡聚糖：40g
14、硫酸葡聚糖， 100ml 8X SSC 4.1%多聚甲醛：1g 多聚甲醛， 100 ml 1X PBS(不溶时可放入 60水浴锅) 5.70%FA 甲酰胺/2X SSC( pH7.0, 100ml): 70ml 100%甲酰胺，10ml 20XSSC, 20ml ddH2O 6.50%FA 甲酰胺/2X SSC( pH7.0, 100ml): 50ml 100%甲酰胺，10ml 20XSSC, 40ml ddH2O 7.0.075M KCl: 1.12gKCl, 200ml ddH2O8.60%杂交液: FA 600l, 40%D.S 250l, 1% Tween (10l Tween ), ddH2O 140l (反复吸打)9.50%杂交液: FA 500l, 40%D.S 250l, 1% Tween (10l Tween ), ddH2O 240l (反复吸打)备注：本 protocol 主要内容由协和肿瘤所王明荣老师实验室友情提供，部分内容根据实际 情况稍作修改或予以补充。Protocol 中蓝色标记为实验中需要特别注意的地方和某些步骤 的说明，红色标记为可替换的步骤或数据。整理人：习 杨2008 年 4 月 29 日
