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1、FDA-PI双色荧光法检测藻细胞活性的研究实验方案一、藻培养二、细胞悬液的配制在 10ml 藻细胞液中加入1ml 鲁哥氏溶液8，于黑暗中放置48h，使细胞固定。固定后的细胞已全部失去活性，但细胞个体没有破碎分解。 固定后的藻细胞液在 3000 rmin-1转速下离心，用培养基重悬3-4 次，直到将鲁哥氏溶液清洗干净，溶液变成无色。重悬后的细胞作为死亡细胞染色检测。三、单染色法 -FDA (双醋酸荧光素 ) 染色（1）配制溶液：将 FDA 溶于丙酮中，配成浓度为5 mg.ml-1的溶液，置于 4冰箱中保存。染色时将FDA 加入到藻细胞液中，使其终浓度为100 g.ml-1。（2）活细胞染色：取处
2、于对数增长期的藻细胞液，离心浓缩，蒸馏水清洗1 次，加入 FDA，在室温黑暗处放置5 min 染色；染色后离心，蒸馏水清洗1-2 次，最后用蒸馏水悬浮细胞，涂片观察。（3）死亡细胞胞染色：取上面鲁哥氏溶液固定的死亡细胞按活细胞相同的方法进行染色。（4）观察：用荧光显微镜观察和拍照（明场和荧光分别拍照，物镜使用20） 。活细胞被 FDA 染成亮绿色，当细胞膜受损，荧光素无法在细胞内累积，而使细胞无法发出荧光。 活性高的细胞发出强烈的绿色荧光，活性弱或死亡的细胞发光较弱或不发光。（5）计数：对（ 2） 、 （3）中的发荧光活细胞的数量和总细胞数量进行统计，计算细胞的染色效率。活性率=染色细胞 /观
3、察总细胞个数 100%。（6）实验重复三次。四、单染色法 -PI (碘化丙锭 ) 染色（1） 配制溶液： PI 用 DPBS 缓冲溶液 (Dulbecco s phosphate buffered saline，Hyclone) 配成浓度为 400 g.ml-1溶液，置于 4冰箱中保存， 染色时终浓度为 60 g.ml-1。（2）活细胞染色：取处于对数增长期的藻细胞液，离心浓缩，蒸馏水清洗1 次，加入 PI，在室温下放置 5 min 染色；染色后离心，蒸馏水清洗1-2 次，最后用蒸馏水悬浮细胞，涂片观察。（3）死亡细胞胞染色：取上面鲁哥氏溶液固定的死亡细胞按活细胞相同的方法进行染色。（4）观察
4、：用荧光显微镜观察和拍照（明场和荧光分别拍照，物镜使用20） 。当细胞膜完好时， P I 不能进入细胞内，当细胞凋亡或死亡后，因为细胞膜缺损而进入细胞。 PI 与细胞内 DNA 和 RNA 物质相作用生成红色荧光物，使死亡细胞发出红色荧光。（5）计数：对（ 2） 、 （3）中的发荧光活细胞的数量和总细胞数量进行统计，计算细胞的染色效率。活性率=1-染色率。（6）实验重复三次。五、双染色法（1）配制溶液： FAD 和 PI 溶液配制同上。（2）活细胞染色：取处于对数增长期的藻细胞液，离心浓缩，蒸馏水清洗1 次。加入 FDA，振荡混合均匀后加入P I，也在室温下放置5 min；染色后离心，蒸馏水清
5、洗 1-2 次，最后用蒸馏水悬浮细胞，涂片观察。（3）死亡细胞胞染色：取上面鲁哥氏溶液固定的死亡细胞按活细胞相同的方法进行染色。（4）观察：用荧光显微镜观察和拍照（明场和荧光分别拍照，物镜使用20） 。用荧光显微镜观察和检测。 活细胞被染成亮绿色， 而死亡细胞被染成红色。 发绿光的为活细胞，而发红光的为死亡细胞。（5）计数：对（ 2） 、 （3）中的发荧光活细胞的数量和总细胞数量进行统计，计算细胞的染色效率。活性率=发绿光细胞数 /（发绿光细胞数 +发红光细数）100%。（6）实验重复三次。六、缓冲液配方磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（ 0.2M）pH 0.2M Na2HPO4/m
6、l 0.2M NaH2PO4/ml 6.9 55.0 45.0 7.0 61.0 39.0 7.1 67.0 33.0 Na2HPO4?2H2O分子量 178.05 0.2M 溶液含 35.61g/L NaH2PO4?H2O分子量 138.01 0.2M 溶液含 27.6g/L Na2HPO4?12 H2O 分子量 358.22 0.2M 溶液含 71.64g/L NaH2PO4?2H2O分子量 156.03 0.2M 溶液含 31.21g/L 七、鲁哥氏溶液配方Lugol s溶液，也就是碘液。取 6 克碘化钾溶于 20 毫升蒸馏水中，搅拌到溶解后，加入4 克碘，等碘充分溶解，再加入 80 毫升蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。碘液用来测试食物样品或叶片中的淀粉，也用作染色剂，例如可染色鞭毛、纤毛和细胞核等。
