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1、 中南林业科技大学 大学生研究性学习和创新性实验计划 项 目 结 题 报 告 项目名称 磷胁迫对杉木木质素形成的影响 项 目 主 持 人 蔡迪 所在学校及院系 中南林业科技大学生命科学与技术学院 项目级别 国家级 省级 校级 项 目 实 施 时 间 2015.03-2017.03 指导老师 周波 联系电话 15574813749 填表日期 2017.04 中南林业科技大学 教 务 处 制 一、基本情况 项目名称 磷胁迫对杉木木质素形成的影响 立项时间 2015.03 完成时间 2017.03 项 目 主 要 研 究 人 员 序 号 姓 名 学号 专业班级 所在院 （系） 项目中的 分 工 1
2、蔡迪 20130443生物技术 生科 胁迫处理,基因 表达分析 2 陈静 20130480生物技术 生科 RNA 提取 3 陈玉芳 20130481生物技术 生科 杉木栽培 4 陈曦 20140466生物技术 生科 基因克隆 5 戴婕 20140468生物技术 生科 木质素含量 测定 二、研究成果简介 项目成果类 型 产品 系统软件 论文 专利 其它 （注：请在相应成果复选框内打“”，其它请具体说明） 项目成果名 称 Phosphorus affects Lignin biosynthesis in Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook (Submitted
3、 to plant cell Reports) 项目研究的目的、意义；研究成果的主要内容、重要观点或对策建议；成果的创新特色、实践意义和社会影响；研究成果和研究方法的特色。限定在 2000 字以内。 一、研究的目的一、研究的目的 研究磷是怎样影响杉木木质素的形成。杉木因其材质优良等优点，是我国南方地域十分重要的用材树种之一。木质素合成路径非常复杂，近年来，研究者们已逐步推断并证明 CAD、PAL、CCR、CAD、COMT、CCoAOMT 等基因参与木质素生物合成； 磷是亚热带土壤中较缺乏元素之一， 但磷对杉木木质素形成影响未见报道，分子机理尚不清楚 二、研究成果主要内容二、研究成果主要内容 我
4、们在一年中的 3 月到 11 月，每月用不同浓度梯度的磷肥（主要成分为五氧化二磷）处理 2 年生的杉木植株，并设置对照植株（不用磷肥处理） 。每月施肥前同时取处理材料和对照材料的杉木枝条，每隔 15 天取多年生幼苗嫩茎并分成三份，第一：用来提取 RNA，并将 RNA 逆转录成为 cDNA，用荧光定量 PCR 检测各时期不同磷胁迫处理时木质素合成相关酶基因表达模式； 第二： 同时测定木质素含量；第三：用间苯三酚染色及冰冻切片法观察木质素分布和积累情况。 三、主要观点及对策建议三、主要观点及对策建议 1、不同磷浓度条件下杉木幼苗木质素含量分析 土壤中磷的浓度和成分影响植物的生长发育过程， 也会不同
5、程度地对植物次生长造成影响。 木质素大量存在于杉木中， 其含量也会因不同浓度的磷浓度梯度处理而产生相应的变化。 为了证实这一观点， 本研究首先在相同的生在环境条件下的培养杉木幼苗，从而获得生长势、生理特征相似的多年生幼苗共 12 株，并将杉木幼苗平均分成四组以便日后用不同的磷浓度处理，我们首先使用溴乙酰-紫外分光光度法测定三组试验组杉木幼苗在每次用不同浓度梯度的磷处理后的杉木茎木质素含量和对照组杉木幼苗茎的木质素含量。 如图，我们通过比较发现，在 7 月 28 日到 8 月 12 日期间，C、L、H四种磷胁迫处理结果显示杉木幼苗茎木质素含量增加。 其中，Cl4Cl 基因在未加 KH2PO4的对
6、照组中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 14.8 倍、升高 6.8 倍、降低 10 倍、升高 24.5 倍；Cl4Cl 基因在低磷胁迫（KH2PO4为 8 mg kg-1，下同）时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 4.7 倍、升高 2.0 倍、降低 19.8 倍、降低 3.2 倍；Cl4Cl 基因在正常供磷（KH2PO4为 16 m gkg-1，下同）中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次降低 7.0 倍、降低 7.6 倍、降低 9.0 倍、降低 5.5 倍；Cl4Cl 基因在高磷胁迫（KH2PO4为
7、 24 mgkg-1，下同）中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 12.8、降低 8.2 倍、降低 6.4 倍、降低 6.0 倍。 其中，ClC3H 基因在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 8.3 倍、升高 8.4 倍、降低 1.6 倍、升高 2.4 倍；ClC3H 基因在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 8.0 倍、升高3.4 倍、升高 15.4 倍、升高 21.6 倍；ClC3H 基因在正常供磷中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量
8、依次降低 13.3 倍、降低 7.0 倍、降低 2.4 倍、降低 2.0 倍；图 1.不同浓度梯度磷胁迫情况下木质素合成酶关键基因不同时期的表达量 ClC3H 基因在高磷胁迫中， 8.12、 8.27、 9.12、 9.27 四个时期的表达量依次升高 16.2、降低 2.7 倍、升高 15.7 倍、降低 1.5 倍。 其中，ClPAL2 基因在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 5.9 倍、升高 4.2 倍、升高 2.4 倍、升高 23.2 倍；ClPAL2 基因在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依
9、次升高 6.3 倍、升高6.9 倍、升高 61.5 倍、升高 186 倍；ClPAL2 因在正常供磷中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次降低 2.6 倍、降低 5.7 倍、升高 1.6 倍、升高 9.3 倍；ClPAL2 基因在高磷胁迫中， 8.12、 8.27、 9.12、 9.27 四个时期的表达量依次升高 4.8、降低 9.8 倍、升高 1.4 倍、升高 2.2 倍。 其中，ClCCR1 基因在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 5.3 倍、升高 3.3 倍、降低 2.3 倍、不变；ClCCR1 基因
10、在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 4.4 倍、升高 2.3 倍、升高 2.0 倍、升高 4.5 倍；ClCCR1 因在正常供磷中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次降低 5.0 倍、降低 2.9 倍、降低 1.4 倍、降低 2.8 倍；ClCCR1 基因在高磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 7.1、降低 5.4倍、升高 12 倍、降低 1.4 倍。 其中，ClC4H 基因在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 12 倍、升高
11、 3.3 倍、升高 1.6 倍、升高 19；ClC4H 基因在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 4.5 倍、升高 4.0倍、升高 80 倍、升高 1.1 倍；ClC4H 因在正常供磷时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次降低 2.6 倍、升高 1.5 倍、升高 6.8 倍、升高 46 倍；ClC4H 基因在高磷胁迫时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 15、升高 1.2倍、升高 1.3 倍、升高 4 倍。 其中，ClCAD2 基因在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9
12、.27 四个时期的表达量依次升高 4 倍、升高 3.9 倍、降低 2.3 倍、升高 24.8 倍；ClCAD2 基因在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 5.3 倍、升高3.2 倍、升高 6.8 倍、升高 258 倍；ClCAD2 因在正常供磷时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次降低 6.1 倍、降低 1.3 倍、升高 3.4 倍、升高 7.3 倍；ClCAD2 基因在高磷胁迫时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高14 倍、升高 1.2 倍、降低 3.7 倍、降低 1.3 倍。 其中，ClCOM
13、T 基因在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 10 倍、升高 2.8 倍、升高 2.3 倍、升高 4.5 倍；ClCOMT 基因在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 5.9 倍、升高1.3 倍、升高 8.6 倍、升高 25 倍；ClCOMT 因在正常供磷时，8.12、8.27、9.12、9.27四个时期的表达量依次降低 5.1 倍、 降低 9.6 倍、 升高 1.4 倍、 升高 1.1 倍； ClCOMT基因在高磷胁迫时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 18
14、倍、升高 4 倍、升高 6 倍、升高 3.7 倍。 其中，ClCCoAOMT 基因在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9.27四个时期的表达量依次升高 14.7 倍、升高 2.7 倍、升高 30 倍、降低 1.2 倍；ClCCoAOMT 基因在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次降低 1.8 倍、 升高 2.4 倍、 降低 5 倍、 降低 1.6 倍； ClCCoAOMT 因在正常供磷时， 8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 2.5 倍、不变、升高 500 倍、升高 1.1倍；ClCCoAOMT 基因在
15、高磷胁迫时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 11 倍、升高 4 倍、不变、降低 1.5 倍。 在 7 月 28 日到 9 月 27 日期间，我们每隔 15 天取样并测定杉木幼苗茎木质素含量的结果显示， 杉木幼苗茎的木质素含量随磷处理的浓度和磷的积累的增加而先降低而后逐步增加， 增加量远远超过对照组杉木幼苗木质素含量。 这说明不同浓度磷浓度处理在木质素积累过程中发挥了重要作用。 高浓度磷酸盐的吸收和转运活性的增加可能促进了木质素的积累； 低浓度磷酸盐的吸收的增加可能抑制了木质素的合成，至少是处在正常土壤无机磷浓度范围内时，在幼苗时期是能够观察到的。 2、杉木幼苗
16、茎木质素含量及组织化学分析 作为植物主要的组成部分， 木质素的合成受到土壤无机磷浓度影响。 为了证明这一观点， 我们在酸性条件下， 将木质化的细胞壁经过间苯三酚染色呈现红色或者紫红色， 染色区域大小和深浅可以反应木质化程度。 在我们测定杉木木质素含量时，对不同浓度梯度磷处理的杉木幼苗茎进行冰冻切片处理，再利用组织化学染色方法，直接观察分析不同时期和不同浓度梯度磷胁迫条件下的木质素分布情况。 从图中可以看出，木质素在未加 KH2PO4的对照组中，8.12、8.27、9.12、9.27四个时期的表达量依次升高 1.10 倍、升高 1.07 倍、升高 1.03 倍、升高 1.08 倍；木质素在低磷胁迫中，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 1.63 倍、升高 1.79 倍、升高 2.01 倍、升高 1.33 倍；木质素在正常供磷时，8.12、8.27、9.12、9.27 四个时期的表达量依次升高 2.01 倍、
