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1、 第八章 菌种的保藏第一节 菌种的衰退和复壮一、菌种的衰退二、菌种的复壮第二节 菌种的保藏一、菌种保藏的目的二、菌种保藏的原理三、菌种保藏的方法l 性状稳定的菌种是微生物工作最 重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。l 影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡第一节 菌种的衰退和复壮 在微生物的基础研究和应用研究中，选育 一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲 使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性， 便于长期使用，还需要做很多日常的工作 。实际上，由于各种各样的原因，要使菌 种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种 潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些 规律，才能采取相应的措施
2、，尽量减少菌 种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。一、菌种的衰退 菌种衰退（degeneration）是指由于自 发突变的结果，而使某物种原有的一系列 生物学性状发生量变或质变的现象。 纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体不纯菌种衰退菌种（一）菌种衰退的现象l 菌落和细胞形态改变l 生长速度缓慢，产孢子越来越少l 代谢产物生产能力下降，即出现负突变l 致病菌对宿主侵染能力下降l 对外界不良条件的抵抗能力下降等（二）菌种衰退的原因l 基因突变主要原因1、有关基因发生负突变导致菌种衰退2、表型延迟造成菌种衰退3、质粒脱落导致菌种衰退l 连续传代加速衰退l 不适宜的培养和保藏条件加速衰退（三）菌种衰
3、退的防止l 控制传代次数l 创造良好的培养条件l 利用不易衰退的细胞移种传代l 采用有效的菌种保藏方法l 讲究菌种选育技术l 定期进行分离纯化二、菌种的复壮n 狭义的复壮消极的措施是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯 种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已 衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有性状的相应措施。n 广义的复壮积极的措施是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰 退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个 体。菌种复壮的主要方法 纯种分离法菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体 中一
4、部分仍保持原有典型性状的单细胞分离 出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性 状。 宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接 种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的 毒性。 淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药 物、低温、高温等），往往可以起到淘汰 已衰退个体而达到复壮的目的。 遗传育种法把退化的菌种重新进行遗传育 种，从中再选出高产而不易退化的 稳定性较好的生产菌种。 第二节 菌种的保藏菌种是重要的生物资源，研究和选择良 好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的n 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持 其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死 亡、不变异、不被污染，以达到便于
5、研究 、 交换和使用等诸方面的需要。二、菌种保藏的原理 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行 保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢 子、芽孢等。 其次应人为地创造环境条件（如：干 燥、低温和缺氧），使微生物长期处 于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休 眠状态。 尽可能多的采用不同的手段保藏 一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法 各种微生物由于遗传特性不同， 因此适合采用的保藏方法也不一 样。一种良好的有效保藏方法， 首先应能保持原菌种的优良性状 长期不变，同时还须考虑方法的 通用性、操作的简便性和设备的 普及性。 斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空
6、干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法（一）斜面低温保藏法常用保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存16个月左右。 优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。（二）石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物
7、与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4冰箱内保藏。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏 不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保存12年左右。（三）砂土管保藏法 一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。n砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它的保藏期约110年。n 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例 分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121蒸汽灭菌1 1.5h，间歇灭菌3次。50烘干后经检查无
8、误后备用。将 待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线 菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器 中抽真空约24h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置 于干燥器中，在室温或4冰箱内保藏。 （四）麸皮保藏法 又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因
9、操作简单、经济实惠，工厂较多采用。（五）甘油悬液保藏法 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下 保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温 度若采用20，保藏期约为0.51年，而采用 70，保藏期可达10年。 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经 121蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘 油的终浓度在1015，再分装于小离 心管中，置低温冰箱中保藏。 基因工程菌常采用本法保藏。（六）冷冻真空干燥保藏 法 又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制 备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低 温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品 脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块
10、。并在真空条件下立 即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物 处于休眠状态，而得以长期保藏。n 此法适用于各大类微生物。n 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达515年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。n 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。（七）液氮超低温保藏法 简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作 为保护剂，在液氮超低温（196）下保藏的方法。其 主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之 前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因 自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。 此法适用于各种微
11、生物菌种的保藏。 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保 藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有 效的菌种长期保藏技术之一。 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种 培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置 超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用 较高。（八）宿主保藏法 此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、 立克次氏体等）。 植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合， 冷冻或干燥保存。 噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基 混合直接保存。 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体 液，然后分装于试管中密封，低温保存。 在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法
12、最为简便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。 美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和液氮保藏法来保藏所有菌种。 我国CCCCM采用斜面低温保藏法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行菌种保藏。ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图； http:/ wkd61xny 名字与你们知道的不同，所以我把它画下来吧。”说完，就走到桌前，提起毛笔就开始在纸上画起来了。梦瑶走到司无言身旁看着画纸 上的一个个草药的样子，司无言画的很逼真，所以梦瑶看了一眼就知道是什么草药了。司无言一口气画出了五十多种草药，将画纸吹干
13、再卷起来交给梦瑶，严肃的说道：“就是这些草药了，越早找到越好，找不到你再跟我说。”梦瑶接过画纸笑呵呵的说道：“无言大哥 你画的非常的栩栩如生啊，我看一眼就知道是什么草药了，放心吧这些药我都能找到，三天后我全部都找到带回来给你。”司无言笑着 点了点头，梦瑶就跟夜北冥说了声就自己走了。看着房间中就剩下自己跟夜北冥两个人，司无言紧张又害羞的不知道手脚往哪里放了。 精神力看到司无言害羞的小动作，夜北冥无声的笑了笑，许是被夜北冥嘴角的笑容惊艳到了，司无言看的心脏都快要跳出来了，那 粉色的嫩唇，还有洁白的牙齿，往深处看还能看到粉-嫩的软舌。司无言悄悄的吞了吞口水，轻声叫到：“冥？”“嗯？”“你相信我 吗？
14、”“为什么不信？”第020章 混沌丹田“你想修炼吗？”夜北冥看着低头沉思中的司无言瞬间的开口问道。“什么？”司无言疑惑 的抬头看着夜北冥问。“你的废脉并不是没有办法个治，如果你想修炼，我可以现在就帮你打通。”司无言一听，想到夜北冥被毒素侵 略而导致失明的眼睛，还有夜北冥心脏处的那只充满了吞噬性的蛊虫，忽然想到，这些危险的东西，是不是别人放进夜北冥身体里的呢 ？夜北冥是不是有非常强大的敌人？那这么软弱的自己留在冥的身边岂不是会成为她的拖累？想到有一天夜北冥与敌人战斗，而自己却 因为不能修炼而帮不上夜北冥的忙，而夜北冥身边应该是不会允许一个不能修炼的废物的。废物？我堂堂佣兵之王，岂会成为一个废物
15、？为了长久的留在夜北冥身边，所以司无言对着夜北冥重重的点了地下头，忽而想到这样夜北冥看不见，于是郑重的说道：“我想修炼 ！”夜北冥欣慰的点了点头，走到司无言身前，说道：“我带你去个地方！”说完，一只手搂着司无言的腰，体内神力一转，就已经在 房间中消失了。落叶森林深处的一处山洞内，夜北冥搂着司无言的身影出现在山洞里的一处泉水边缘，刚从急速稳定下来，司无言就发 现了眼前的一汪冒着热气的泉水，因为夜北冥在行进过程中开启了气罩，所以司无言没有受到寒流的影响，现在他觉得很热。泉水一直 在冒着气泡，可知这泉水的温度有多高，泉水的周围都是红色的石头，石头表面遍布小孔和裂痕，看起来感觉很干燥。司无言对着身旁 站立的夜北冥疑惑的问道：“冥？我们来这里做什么？”“脱衣服！”夜北冥冷静的开口。“咳咳，什么？脱衣服？这、这、这不太好
