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1、1.简述一下内切酶和连接酶的作用机制。内切酶：类型 I、III：都有甲基化，依赖于 ATP，限制内切酶活性。III 型酶在识别部位进行切割，很容易从底物上解离。I 型酶是随机切割，识别部位不等于切割部位，能产生不同的末端。则 I 型和 III型不同，很难形成稳定的切割末端。类型 II 的特点：识别部位等于切割部位。在DNA 分子双链特异性识别部位切割产生特定的 DNA序列。两个单链断裂部位在 DNA 分子上的分布通常不是彼此相对的。断裂的结果形成的 DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。连接酶：能够催化双链 DNA 片段紧靠在一起的 3OH末端于 5P 末端之间形成磷酸二脂键，使两末端连接。
2、连接方法：用DNA 连接酶连接具有互补的黏性末端片段。用T4DNA 连接酶将平末端片段连接。平末端片段加上衔接头或人工合成的连杆使之成为黏性末端后用DNA 连接酶连接。2.比较基因工程中常用的DNA 聚合酶的催化活性有什么不同？修饰酶：DNA 聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶（特点：a 53聚合酶活性 b 53外切酶活性c 35外切酶活性）大肠杆菌 DNA 聚合酶大片段（a 53聚合酶活性 b 35外切酶活性）T4噬菌体 DNA 聚合酶T7DNA 聚合酶（催化合成的 DNA 链比其他的长）耐热 DNA 聚合酶（7580，耐高温，用于 PCR中）逆转录 DNA 聚合酶（依赖于 RNA 的 DNA
3、 聚合酶）末端转移 DNA 聚合酶（将平末端修饰为黏性末端）T4噬菌体多核苷酸聚合酶S1核酸酶（降解双链 DNA,单链 RNA）Bal3 核酸酶（具有高度的、特异的脱氧核苷酸内切酶活性）碱性磷酸酶（细菌碱性 BE（DAP）去除 5端磷酸，提高重组效率）3.基因工程中常用载体，具有哪些性质?(1)能在宿主细胞中进行独立和稳定的 DNA 自我复制。（2）易于从宿主细胞中分离并进行纯化。 （3）在其DNA 序列中具有适当的限制性 DNA 内切酶位点（最好是单一的识别位点） 。（4）具有能够观察的表型特征。4. 质粒载体的类型以及质粒 DNA 复制类型，他们之间的关系？细菌质粒载体：生物特性：定义：存
4、在于细胞质中的一种独立于染色体外，自主复制的遗传成分，游离，在特定条件下，可逆整合到染色体内类型：接合型（是必需遗传信息，还带有一套控制细菌细胞配对和转移基因。分子量大，低拷贝，严密型。 ）和非接合型（是必需遗传信息，丧失了自我转移能力。分子量小，高拷贝，松弛型。 ） 。其条件：具有复制起点；带有可选择的标记；含有若干限制酶单一的识别位点；分子量小；拷贝数较高。转移能力与分子量大小以及 DNA 复制类型有关。质粒 DNA 复制类型：一个质粒就叫拷贝数。 （1）底拷贝数质粒：DNA 复制是属于严紧复制控制的。（2）高拷贝数质粒：DNA复制是属于松弛性复制控制的。5. 简述质粒、柯斯质粒和入噬菌体
5、等的特性入噬菌体的特性：定义：把专门感染了细菌的病毒称为噬菌体载体，由 DNA和蛋白质组成。 （1）溶源：若噬菌体侵入宿主细胞后并不裂解宿主细胞，而是把自身 DNA 整合到宿主细胞 DNA 中，并随着宿主细胞分裂而增殖。 （2）裂解：若噬菌体侵入宿主细胞后可以利用宿主细胞的酶以及底物合成新的噬菌体，然后破裂细胞释放出子代噬菌体并再次感染其它宿主。柯斯质粒的特性：含有质粒的复制起点和药物抗性基因。含有入噬菌体的 cos 基因位点。分子量较小，但是具有高容量的克隆能力。具有于质粒同源序列的质粒进行重组的能力。6. 基因重组的定义利用限制性内切酶和其它一些酶类，切割和修饰载体 DNA 和目的基因，将
6、两者连接起来，使目的基因插入语可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性目的基因在受体细胞内得到正确表达。7. 载体 DNA 与外源基因链接的方法有哪几种？（1）黏性末端连接法：DNA 连接酶，辅助因子NAD+提供能量。（2）平末端连接法：同聚物加尾法：利用末端脱氧核苷酸转移酶，不直接使用 T4DNA 连接酶，连接效率低。衔接物连接法：用化学方法合成的，由1012 个核苷酸组成，具有 1 个或数个限制性内切酶位点的平末端双链寡核苷酸片段称衔接物。人工接头连接法：一端是平端，另一端是黏性末端，衔接物两端都是平末端。8. 阐述外源基因导入受体细胞的途径。受体细胞：是指能够摄取外源 DNA
7、，并使其稳定扩增以及表达的细胞。不同导入原核受体细胞的方法：转化：把以质粒为载体，构建的重组分子导入受体细胞的方法。转导：以噬菌体或真核病毒为载体构建的重组分子导入受体细胞的方法。三亲本杂交：将含有重组 DNA 分子的供体菌，被转化的受体菌含有辅助菌，在辅助菌作用下，将供体菌导入到受体菌中。不同导入真核受体细胞的方法：导入酵母中：对酵母进行转化的两种方法：a.细胞壁在 CaCL2 或多聚醇作用下，细胞壁具有穿透性，允许外源基因进入。b.用 Li+盐进行处理，细胞能够允许外源基因进入。导入植物中细胞中：主要采用致癌农杆菌制导下的以后 Ti 质粒为载体的，土壤杆菌诱发植物产生肿瘤进行转化的方法。导
8、入动物细胞中：a.物理、化学法 b.生物法。9. 组织培养的概念及其大概步骤。植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。步骤：预备阶段：选择合适的外植体除去病原菌及杂菌配置适宜的培养基诱导去分化阶段继代增值阶段生根发芽阶段移栽成活阶段10. 植物细胞培养的基本方法有哪些？植物细胞培养：在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织接种到培养基培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞的一种增值方式。培养方法：单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养。（1）单倍体培养：花粉培养。小孢子胚状体完整植株。 （2）单
9、细胞培养：a.制备：机械法、酶解法、愈伤组织诱导。b.方法：平板培养法、看护培养法、饲养层培养法、液体浅层静置培养法、细胞悬浮培养。 （3）大规模培养：生物反应器的选择：合适的氧传递良好的流动性低的剪切力。类型：机械搅拌、鼓泡、气生循环式。影响因素：遗传特征：不同部位合成此生代谢产物能力不同培养条件：光照温度搅拌与混合通气营养盐pH 值前提和调节因子。培养方法：尽可能快的使细胞增加诱发和保持旺盛的次生代谢，保证细胞次生代谢产物的合成积累。11. 植物细胞大规模培养采用的方式，培养过程中有哪些影响因素？参考 10 问。12. 原生质体的融合过程和结果是什么？13. 单倍体植株形单体弱，为什么要产
10、生单倍体植株？单倍体育种的优越性：（1）缩短杂交育种时间，并克服杂交育种困难（2）显著提高了选育效率（3）克服了缘缘杂交的不孕性，创造了新新的品种14. 人工种子包括哪几部分？如何制备人工种子？人工种子包括：人工种皮、胚状体、人工胚乳。人工种子的制备：胚状体的诱导、包裹制种、发芽试验。15. 发酵工程的发展经历那几个时期？天然发展阶段第一个转折时期：纯培养技术第二个转折时期：通气搅拌技术第三个转折时期：代谢控制发酵第四个转折时期：基因工程技术16. 灭菌下发酵工业的应用范畴。微生物菌体发酵微生物酶发酵微生物代谢产物发酵微生物转化发酵现代生物技术的生物细胞发酵微生物处理废水及其他方面的发酵17.
11、 发酵工程包括那几个阶段？1、菌种的选育 2、微生物的发酵生产 3、发酵产品的下游加工过程。18. 发酵液预处理的方法有哪些？预处理的目的：改善发酵液的性质，以利于固液分离，常用酸化、加热和加絮凝剂等方法。去除Ca+Fe+等，加入草酸或草酸钠。去除杂蛋白质，加入三氯乙酸盐。去除有色杂质，加入活性炭。19. 发酵工程下游精制和提取方法是什么？精制地方法：层析分离法（吸附层析） 。提取的方法：沉淀法、萃取法、吸附法、离子交换法、超滤法。20. 在生产酶的过程中采取什么方法提高酶产量？添加诱导物添加促进剂控制阻遏物的浓度代谢终产物分解代谢物。21. 简述酶分离纯化的过程？（1）材料的预处理：防止蛋白
12、酶的水解作用，分离细胞器，除去核酸。 （2）细胞的破碎：机械匀浆法，超声波法，冻融法，渗透压法，酶水解法。 （3）酶的抽提。 （4）酶的分离纯化：沉淀分离法，层析法，电泳法，离心法。22. 通过哪些方式改造酶分子来满足实践需求？（1）增加酶的稳定性（2）通过化学酶法修饰来改变酶的活性（3）消除免疫性或抗原性以利于在医疗上的应用。23. 将固定化酶与游离酶比较，优势是？固定化酶：通过物理或化学方法将酶束缚在一个区间内制成具有一定催化作用的衍生物。其优点是：（1）可使反应过程管道化、自动化，产物易从反应液中回收；（2）酶的稳定性有所改进；（3）酶的作用效率提到。24. 如何制定固定化酶？1、载体结
13、合法：共价结合法，离子吸附法，物理吸附法。2、胶连法：双功能试剂。3、包埋法：聚合物包埋法，微胶囊包埋法。25. 固定酶性质的变化主要表现在哪几方面？1、酶活性的变化 2、最适 pH 的变化 3、最适温度的变化 4、动力学常数的变化 5、酶稳定性发生变化26. 设计酶反应器应尊寻一定原则是什么？总体要求：通用、简单、损耗低、易操作 1、根据所有用酶和底物的酶促反应特性及温度、压强、pH更因素对反应影响而设计；2、根据酶反应器中的流体、流动状态以及导热特性选择设计酶反应器；3、根据生产规模、生产量和工艺流程进行设计；4、在综合考虑酶生产流程相应的辅助过程以及两者的相互作用和结合方式的基础上，力争使整个实行经济、社会、时间和空间的最优化27. 如何选择一类酶的反应器？1、根据固定化酶的形状来进行选择 2、根据底物的物理性质来进行选择3、根据酶反应动力学特征来进行选择 4、根据酶的稳定性来进行选择 5、根据操作要求以及反应器的费用来进行选择。
