微生物育种学全套讲义

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1、微生物育种学 第一章 绪论 主要内容： 工业微生物育种在发酵工业中的地位；工业微生物育种的进展；工业微生物育 种的方法 第一节 工业微生物育种在发酵工业中的地位 现代发酵工业迅猛发展的原因： 发酵工艺改进和发酵设备更新； 进行菌种的选育及其改良，为发酵工艺提供了人类需要的各种类型的突变菌株 使抗生素、酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、核苷酸、激素、生物碱、不饱和脂肪酸以 及其他生物活性物质等产品的产量成倍甚至成千倍地增长，同时产品的质量也不断提高。 工业微生物育种的重要意义: 1、提高发酵工业产品的产量和质量 2、开发利用微生物资源，增加发酵工业产品的品种 工业微生物菌种的筛选 理想的工业发酵菌

2、种（是工业微生物技术的关键和基础）必须具有下述特性: 1.纯培养物;2.遗传性状稳定;3.生长速度快;4.能利用廉价、来源广、成分简单的培养基；5. 忍耐不良环境能力强;6.快速生产目的产物. 微生物菌种的获得 微生物的自然分布 土壤中的大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来 源。 微生物菌种获得的途径 菌种的来源 工业微生物的直接来源 向菌种保藏机构索取有关的菌株 微生物菌种分离筛选过程 （一）微生物样品的采集： 1.土壤采样:土壤有机质含量和通气状况;土壤的纵剖面;土壤 pH;表面的植被;地理条件;季节 条件. 2.根据微生物生理特点采样 微生物的营养需求和

3、代谢类型与其生长的环境有很大相关性;具有特殊性质的微生物的筛选;海洋微生物能够产生不同于陆地来源的特殊代谢物. (二)富集培养 概念: 控制因素: （三）分离纯化： 1.好氧微生物的分离纯化常规的分离方法 平皿反应快速检出法:透明圈法;变色圈法;生长圈法;抑菌圈法 2. 厌氧微生物的分离纯化 (四)菌种筛选、性能评价及菌种的初步鉴定第二节 工业微生物育种的进展 工业微生物育种，无论从自然变异中选择或是人工诱变的选择，都是建立在遗传和变异的 基础上。 遗传和变异是生物界生命活动的基本属性之一。 没有变异，生物界就失去进化的素材； 没有遗传，变异也无法积累。 同样，对于优良菌株的选育， 没有变异，

4、就没有选择的素材； 没有遗传，选到的优良性状，也不能进行培育。 工业微生物育种学是建立在微生物遗传学基础上，两者相辅相成。 微生物本身，在漫长的进化过程中，达到适合于它的生存和繁衍的水平。野生型微生物经 自然选择，能适应它的周围环境，能适应同其他物种的竞争，但却不能按人的意志生产人 们需要的物质。 因此，从人类的利益出发，须对工业微生物菌种进行改良，使之产生数量远远超出微生物 本身需要的物质，或者不是它正常产生的新物质。 对工业微生物菌种进行有目的的改良，是在有关微生物遗传学知识被人们了解并掌握之后 才成为可能的。同时，这种改良涉及多学科领域。 诱变育种技术的诞生与发展 微生物遗传学诞生；诱发

5、突变技术；抗生素和氨基酸等工业发展需要 自然选育 人工诱变选育 如:抗生素生产，特异青霉表层培养只有 12U/ml 分离出产黄青霉同时伴以沉没 培养成功，达到 20U/ml 经过四十多年的诱变育种，到目前已达 60 000U/ml以上 （比原始菌株的产量提高了上千倍。 ） 其他抗生素品种如链霉素、土霉素、四环素、红霉素及灰黄霉素等，都由原来的几十单位 提高到目前的几万单位。 1981 年，吴松刚教授从我国土壤中分离出灰黄霉素野生型菌株 4541，经耐前体抗性选育， 获得 D-756 变株。短短 6 年，发酵单位提高 60 倍以上，跃居世界领先水平。都由原来的 几十单位提高到目前的几万单位。 又

6、如，代谢控制育种（活力在于以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过了微生物正常代 谢途径的突变株）以 20 世纪 50 年代末谷氨酸发酵取得成功使发酵工业进入第三转折期 代谢控制发酵时期，并在其后的年代里得到飞跃的发展。 从而人为地使有用产物选择性地大量生成积累，并且在有控制的条件下培养，大量地生产 这种有用产物 重组育种技术的诞生与发展 菌株长期使用诱变剂处理之后除产生诱变剂“疲劳效应”外，还会引起菌种生长周期的延长、代谢减慢等，这对发酵工艺 的控制是不利的。杂交育种可以作为育种的另一手段，其成功不仅表现在种内杂交上，而且在种间杂交以至 属间杂交都取得令人满意的结果。 杂交的目的： 把不同菌株的

7、优良经济性状集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的上述缺陷，同 时杂交还是增加产品新品种的手段之一。 从发酵工业微生物育种史，可以看到经典的诱变育种是最主要的育种手段，也是最基础的 育种手段，但是它具有一定的盲目性。代谢控制育种的崛起标志着发展到理性阶段，导致 了氨基酸、核苷酸及某些次级代谢产物的高产菌株大批地投入生产。代谢控制育种作为工业微生物育种最为活跃的领域而得到广泛的应用，它与控制的杂交育 种汇合在一起，反映了当代工业微生物育种的主要趋势。 重组 DNA 技术的诞生与发展 近年来，基因工程在工业微生物菌种选育中的应用得到迅猛发展。世界上以基因工程方法 创造的各种工程菌不计其数 基因

8、工程育种 以微生物为出发菌株利用基因工程方法进行改造而获得的 工程菌，或者是将微生物甲的某些基因导入微生物乙中， 使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物而获得 的新菌种。 实现了人为的菌种选育，一切可以按照人们事先设计和控制的方法进行育种，是一种最新 的最先进的育种技术。 基因工程菌的构建和应用，已在多方面显示出其巨大的生命力。 通过基因工程的方法生产药物已获得包括治疗用的药物、疫苗、单克隆抗体及诊断试 剂等几十种批准上市的品种； 通过基因工程的方法提高菌株生产能力已获得包括氨基酸类（苏氨酸、精氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸等） 、工业用酶制剂（脂肪酶、

9、纤维素酶、乙酰乳酸脱羧酶及淀粉酶等）以及头孢菌素 C 的工程菌，都大幅度提高了生产 能力；通过基因工程的方法改造传统发酵工艺如氧传递有关的血红蛋白基因克隆到远 青链霉菌，降低了对氧的敏感性，在通气不足时，其目的产物放线红菌素产量可提高 4 倍；通过基因工程的方法提高菌种抗性构建包括活性干酵母和酵母工程菌，抗噬菌体谷氨 酸工程菌以及利用工程菌处理工业废料和废水等。 以上诸多类型的基因工程菌的构建，使工业微生物育种突破了传统、经典的育种模式，在 工业微生物育种中展示了极为光明的前景。 微生物遗传育种技术简介 一一、诱变育种：采用物理和化学等因素对出发菌株进行诱变处理，然后运用合理的筛选程 序及适当

10、的筛选方法把符合要求的优良变异菌株筛选出来的一种育种技术。 二、重组育种：利用不同微生物菌株间遗传物质的重组而实现的工业微生物育种技术。 三、重组 DNA 技术：在体外构建重组 DNA 分子并导入宿主内表达，从而获得重组工业微 生物菌种的育种技术。 思考题一、试述工业微生物育种在发酵工业中的地位。二、试述工业微生物育种学的发展 史。三、简述微生物育种技术 第二章 微生物细胞的结构与分裂 本章内容：微生物的细胞结构与功能；细胞分裂；真核微生物的生活史 原核微生物无核膜包围，只有裸露DNA，无有丝分裂，缺少由膜包围的其他细胞器（如 线粒体、内质网、叶绿体等）的原始单细胞生物。 真核微生物细胞核有核

11、膜包围成一个明确的核，能进行有丝分裂，还具有由膜包围的 其他细胞器的生物。 细菌细胞结构与功能 一般构造：如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体、核糖体等，是所有细菌都有的构造 特殊构造：主要有鞭毛、菌毛、性菌毛、糖被和芽孢等，并非所有细菌都有的构造 细菌细胞壁cell wall: 细胞壁是位于菌体的外层，内侧紧贴细胞膜的一层无色透明，坚韧而有弹性的结构。细胞 壁约占细胞干重的 10%25%。主要由肽聚糖构成。 细胞壁的功能：细胞壁赋予细胞以硬度和形状，为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需，并 能阻拦某些大分子物质进入细胞，保护细胞免受有害物质的损伤，它还决定了细菌具有特 定的抗原性、致病性以及对抗生素

12、和噬菌体的敏感性等特有的生理功能。 细胞壁的基本骨架肽聚糖 概念： 肽聚糖是由 N乙酰胞壁酸（NAM）和 N乙酰葡糖胺（NAG）以及短肽链（主 要是四肽）组成的亚单位聚合而成的大分子聚合物。 肽聚糖单体网状结构 NAG 与 NAM 残基以 -1,4 糖苷键交替连接，形成聚糖的骨架（主链） ；一组相同的短肽 侧链接于 NAM 上；相连主链上的短肽侧链通过一条肽桥、或直接相连，从而形成网状分 子结构。 溶菌酶对细胞壁的作用 可切断 NAM 和 NAG 之间的1，4 糖苷键，引起细菌裂解。 对 G菌，在 EDTA 存在下，受溶菌酶作用。 溶菌酶处理后的菌细胞应保存在弱高渗（0.1 0.2M）蔗糖液中

13、。 青霉素对细菌细胞壁的作用Penicillium 与转肽酶结合，而使该酶失活，抑制了侧链末端的丙氨酸与五肽桥的连接，破 坏了细菌细胞壁的完整性（即抑制肽聚糖的合成） ，因此， Penicillium 仅对正在生长着的 细菌，且主要是对 G+菌有效。 细胞壁缺损型细菌 概念：自发突变或人为得到缺壁细菌。 原生质体：人为用溶菌酶除CW或青霉素抑制CW合成得到CM包裹的球状细胞，一般G最易形 成原生质体。 球状体又称原生质球，指还残留了部分细胞壁（尤其是G-细菌外膜层）的原生质体。 共同特点： 对环境条件变化敏感； 即使有鞭毛，也不能运动； 对噬菌体不敏感； 外源基因容易导入，有利于遗传学基本研究

14、； 不同菌种或菌株的原生质体间易发生细胞融合，因而可用于杂交育种。 酵母菌细胞的构造 酵母菌的细胞结构与其他真核生物基本相同，右图是电子显微镜下的酿酒酵母细胞结构示 意图。 酵母细胞的细胞壁 (1)细胞壁结构： 酵母细胞壁呈“三明治”结构 细胞壁 外层：甘露聚糖（约占 40%-45%，以 -糖苷键联结（并非所有酵母菌都有）) 内层：葡聚糖（约占 30-40%，由 D-葡萄糖以 -糖苷键联结） 中间层：蛋白质（含 5-10%，多为酶类） （2）壁外成分： 有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结构。 包括异多糖、甘露聚糖和淀粉类物质。（3）细胞壁的少量组分脂类(3%-8%)和几丁质（1%-2%)和

15、灰分. 蜗牛酶 ：水解酵母菌细胞壁制备原生质体或水解酵母子囊壁以释放单倍体子囊孢子。 霉菌的构造 由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、核糖体、内质网及各种内含物（肝糖、脂 肪滴、异染粒等）等组成。 幼龄菌往往液泡小而少，老龄菌具有较大的液泡。 霉菌细胞壁： 除少数低等水生霉菌细胞壁含纤维素外,大部分霉菌细胞壁主要由几丁质组成. 霉菌的细胞壁可用蜗牛消化酶等消化霉菌的细胞壁，制备霉菌的原生质体。 核质体(nuclear body;nucleoid) 又叫核区、拟核、类核等，由大型环状双链 DNA 纤丝不规则地折叠或缠绕而构成的无核膜、核仁的区域 细菌 DNA： 长度：一般为：0.253mm

16、 例：大肠杆菌的 DNA 长约 1mm。 生长迅速的细菌在核分裂之后细胞往往来不及分裂,所以细胞中常有 24 个核质体，而生 长缓慢的细菌细胞中一般只有 12 个核区，不在染色体复制时期一般是单倍体。 功能：负载遗传信息。质粒(plasmids) 细菌染色体外的共价闭合环状双链的小型 DNA 分子分子量约为100 106 D. 一个 菌细胞可有一或多个质粒,每个质粒上有几十个基因 。 质粒的特点： 1、可以在细胞质中独立于染色体之外（即以游离状态）存在，也可以插入到染色体上以附 加体的形式存在； 2、在细胞分裂时，可以不依赖于细菌染色体而独立进行自我复制，也可以插入到细菌染色 体中与染色体一道进行复制； 3、质粒可以通过转化或接合作用而由一个细胞转移到另一个细胞，使两个细胞都成为带有 质粒的细胞； 4、质