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1、1PCRPCR 设计引物时酶切位点的保护设计引物时酶切位点的保护切割率切割率% 酶酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列 2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG0 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG0 90 900 90 90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA90 90 9090 90 90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA50 90 9090 90 90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCG
2、GATCCGCG10 90 9025 90 90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC0 75 250 90 90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA0 0 500 0 90BstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0 25 250 50 90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG0 0 90 500
3、 0 90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG90 90 9090 90 90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA90 90 9090 90 902酶酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列切割率切割率%2 hr20 hrHind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG0 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG0 90 900 90 90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG0 250 50Nco ICCCATGGG CAT
4、GCCATGGCATG0 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC0 0 0 0 75 750 0 0 0 90 90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG0 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAG
5、GAAAA0 10 10 25 250 10 10 90 90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT10 9090 90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG0 0 00 25 90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG0 0 0 750 25 50 903酶酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列切割率切割率%2 hr20 hrPst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTG
6、CAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0 10 90 90 00 10 90 90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA0 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA0 500 90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA0 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAG
7、TACTTTT10 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA0 0 10 9010 10 50 90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG10 10 0 090 90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT0 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT90 90 9090 90 90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CT
8、AGTCTAGACTAG0 90 75 750 90 90 904酶酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列切割率切割率%2 hr20 hrXho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG0 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA0 25 50 900 75 90 90注释：注释：1 1如如果要加在序列的果要加在序列的 5 5端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 5 5端加端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3 3端
9、加保护碱基，就在酶切位点识端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的别碱基序列（红色）的 3 3端加上相应的碱基（黑色）。端加上相应的碱基（黑色）。2 2切割率：正确识别并酶切的效率切割率：正确识别并酶切的效率3 3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。为什么要添加保护碱基？为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接
10、暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计 PCRPCR 引物时，人为的在酶切位点序列引物时，人为的在酶切位点序列的的 55端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。切割。该如何
11、添加保护碱基？该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的 TmTm 值和各引物的碱基分布值和各引物的碱基分布及及 GCGC 含量。如果某条引物含量。如果某条引物 TmTm 值偏小，值偏小，GC%GC%较低，添加时多加较低，添加时多加 G G 或或 C C，反之亦反。，反之亦反。5为了解不同内切酶对识别
12、位点以外最少保护碱基数目的要求，为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEBNEB 采用了一系采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近靠近 DNADNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上至少加上 6 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。个保
13、护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：实验方法：用用 -32PATP-32PATP 在在 T4T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A2600.1A260 单位的单位的寡核苷酸。取寡核苷酸。取 1?g1?g 已标记了的寡核苷酸与已标记了的寡核苷酸与 2020 单位的内切酶，在单位的内切酶，在 20C20C 条件下分条件下分别反应别反应 2 2 小时和小时和 2020 小时。反应缓冲液含小时。反应缓冲液含 70mM70mM Tris-HClTris-HCl (pH(pH 7.6),7.6), 1010 mMmM MgCl2MgCl2 , , 5 5 mMDTTmMDTT 及适量的及适量的 NaClNaCl 或或 KClKCl（视酶的具体要求而定）。（视酶的具体要求而定）。20%20%的的PAGEPAGE（7M7M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。则可能因为出现发夹结构而降低。
