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1、第 47 卷? 第 5 期2011 年10 月青 岛 大 学 医 学 院 学 报 ACT A ACADEMIAE MEDICINAE QINGDAO UNIVERSITAT ISVol. 47, No. 5October? 2011 收稿日期 2011 ?03 ?18; ? 修订日期 2011 ?05?19 作者简介孙素梅( 1979?) , 女, 在职硕士研究生, 主治医师。 现工作单位: 高密市人民医院。 通讯作者 詹瑛( 1965 ?) , 女,硕士, 主任医师, 硕士生导师。巨噬细胞移动抑制因子表达与复发性自然流产关系孙素梅, 刘芙蓉, 詹瑛, 叶元华, 张宁( 青岛大学医学院附属医院
2、产科, 山东 青岛? 266003)摘要 ? 目的? 探讨巨噬细胞移动抑制因子( MIF) 在早期妊娠妇女血清和妊娠组织中的表达及其与复发性自然流产(RSA) 的关系。方法? 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶连接( SP)方法, 检测 35 例 RSA 病人、 45 例人工流产的正常妊娠妇女( 对照组)早期妊娠绒毛和蛻膜组织中 MIF 的定位与蛋白表达, 采用 RT?PCR 技术检测绒毛和蛻膜组织 MIF mRNA 表达水平, 采用酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测血清 MIF 水平。结果? 两组孕妇绒毛滋养层细胞和蜕膜细胞中均有 MIF 表达, RSA 组绒毛滋养层细胞胞质和蜕
3、膜细胞胞质中 MIF 表达呈淡棕色, 而对照组中呈深棕色。RSA 组绒毛滋养层细胞胞质和蜕膜组织 MIF 蛋白和 MIF mRNA 表达均明显低于对照组, 差异有显著性( t= 7. 089 40. 610, P 0. 05) 。1. 2? 实验方法1. 2. 1 ? 标本采集 ? 采集研究对象空腹肘静脉血 5 mL, 乙二胺四乙酸二钾( EDT A?K2) 抗凝, 分离血清, - 70 ? 保存。流产后收集绒毛及蜕膜组织, 生理盐水冲洗, - 70 ? 冰箱保存。部分标本用于提取RNA, 部分标本固定于 40 g/ L 多聚甲醛中24 h, 石蜡包埋用于免疫组化检测。1. 2. 2 ? 绒毛
4、和蜕膜组织中 MIF 蛋白表达检测 ? 应 用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶连接( SP) 方法, 兔抗人 MIF 多克隆抗体购自武汉博士德有限公司, 染色步骤按试剂盒的方法, 工作浓度1?100。结果判定: MIF 染色阳性细胞为细胞质内出现浅棕色、 深棕色染色, 每例随机取 10 个高倍视野( 400 倍) , 使用病理影像多媒体图文操作系统进行阳性细胞表达面积积分吸光度( IA) 值检测, 连续 观察所选视野中的所有细胞, 记录阳性染色细胞百分率( %) 。以平均 IA ? 阳性细胞百分率 ? 100 作为蛋白表达水平, 并进行半定量分析。1. 2. 3? RT?PCR 技术检测
5、绒毛和蜕膜组织中 MIFmRNA 表达? 总 RNA 提取试剂盒由日本 T AKA?RA 公司提供, MIF 引物由上海生工生物工程技术 服务有限公司合成。根据 Premier 5. 0 软件设计引物, 上游引物: 5 ?GCGAAGGTGGAGT TGT TCCA?3 ?, 下游引物: 5? ?AGAACCGCT CCT ACAGCAAGC?3 ?, 扩增产物长度 130 bp; 内参照 GAPDH 上游引物: 5 ?AACAGCCT CAAGAT CATCAGCAA?3?, 下游 引 物 5?GACT GTGGT CATGAGTCCT TCCA? 3 ?, 扩增产物长度 111 bp。cD
6、NA 的合成按试剂盒说明操作, MIF 扩增条件: 反应体系 20 ?L, 94 ?30 s, 55 ? 30 s, 72 ? 40 s, 共 40 个循环, 72 ? 充分延伸 10 min。PCR 产物行 20 g/ L 琼脂糖凝胶电泳, 结果用计 算机扫描分析, 以 各标本 MIF 与GAPDH 扩增条带的实际灰度值的比值表示 MIF mRNA 的表达水平。1. 2. 4 ? 酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测血清中MIF 水平 ? ELISA 检测试剂盒购自美国 D. R 公司, 操作按说明书进行。标本均为同批测定, 批内变异 5. 7%。 1. 3? 统计学处理采用 SPSS 1
7、3. 0 及 PPMS 1. 5 3统计学软件进行数据处理, 计量资料结果以 ? x ? s 表示, 组间比较采用 t 检验, 相关性分析采用 Pearson 方法。2? 结? 果2. 1? 两组绒毛、 蜕膜组织 MIF 的定位及表达水平两组 MIF 蛋白主要表达于绒毛滋养层细胞胞 质和蜕膜细胞胞质中, RSA 组均呈弱阳性( 浅棕色) 表达, 对照组呈强阳性( 深棕色) 表达; 绒毛滋养层细胞和蜕膜细胞胞核和细胞膜上未见表达。MIF在绒毛间质细胞和蜕膜间质细胞及毛细血管内皮细胞中也有表达。RSA 组绒毛、 蜕膜组织 MIF 蛋白的表达水平均明显低于对照组( t= 35. 455、 40. 6
8、10, P 0. 01) 。见表 1。2. 2? 两组绒毛和蜕膜组织中 MIF mRNA 表达水平的比较两组绒毛组织和蜕膜组织中均可检测到 MIFmRNA 表达( 图 1、 2) 。RSA 组绒毛和蜕膜组织MIF mRNA 表达水平均明显低于对照组, 差异有显 著性( t= 7. 089、 9. 371, P 0. 01) 。见表 1。2. 3 ? 两组血清 MIF 水平比较及其与绒毛及蜕膜组织中 MIF 表达的相关性RSA 组的血清 MIF 水平明显低于对照组( t=8. 903, P 0. 01) 。血清 MIF 水平与绒毛和蛻膜组 织中 MIF mRNA 表达水平均呈正相关( r= 0.
9、 873、0. 657, P 0. 01) ; 与 MIF 蛋白表达水平也均呈正相关( r= 0. 794、 0. 616, P 0. 01) 。见表 1。3? 讨? 论3. 1? MIF 在早期妊娠母胎界面的表达妊娠期各种细胞因子和免疫活性细胞在母胎免 疫耐受调节的过程中起着重要作用, 一旦免疫失衡,将导致不孕、 自然流产、 子痫前期等的发生。研究显示, MIF 在排卵、 胚泡植入、 胚胎发育、 免疫赦免、 分娩发动等生殖活动中具有重要作用 2, 是调节母胎?5 期孙素梅, 等. 巨噬细胞移动抑制因子表达与复发性自然流产关系411M: 标志物, ? 对照组, ? RSA 组, ? 、 ?内参
10、照。图 1? 绒毛组织中 MIF mRNA的表达M: 标志物, ? 对照组, ? RSA 组, ? 、 ?内参照。图 2? 蜕膜组织中 MIF mRNA的表达表 1? 两组绒毛和蜕膜组织 MIF 表达水平及血清 MIF水平的比较(? x? s)组别nMIF 蛋白表达绒毛组织蜕膜组织M IF mRNA表达绒毛组织蜕膜组织血清M IF( ? / ?g ? L- 1)对照组45 65. 50? 6. 20 50. 25? 4. 201. 82? 0. 351. 60? 0. 2018. 21? 4. 40RSA 组35 19. 50? 5. 13 15. 50? 3. 201. 35? 0. 201
11、. 22? 0. 1510. 41? 3. 10界面免疫微环境中免疫细胞、 激素、 细胞因子的中心枢纽因子 4。1996 年, SUZUKI 等 5首次用 North?ern 印迹法和 RT?PCR 方法检测到鼠类生殖器官和早期胚胎中有 MIF 蛋白及 MIF mRNA 的表达, 并发现 MIF 通过控制 IL?1、 IL?6、 TNF?、 CSF?1、 LIF及 GM?CSF 等诸多细胞因子网络, 实现对胚胎植入和妊娠维持的调控, 体外试验还表明 MIF 可通过结 合谷胱甘肽为胚胎的发育提供有益的微环境。AR?CURI 等 6采用免疫组化方法研究显示, MIF 蛋白表达于绒毛内层细胞滋养层和
12、滋养层细胞岛。本研究也检测到 MIF 蛋白在正常早期妊娠绒毛膜滋养细胞和蜕膜细胞的胞质中均有表达, 在细胞核和细胞膜上未见明显表达, 此外, MIF 在绒毛间质细胞和蜕膜间质细胞及毛细血管内皮细胞中也有一定的表达; RT?PCR 检测证实早期妊娠绒毛和蜕膜中均有 MIF mRNA 的表达, 提示 MIF 在母胎界面的表 达可能参与人类胚胎的免疫赦免和早期发育。3. 2? 早期妊娠母胎界面 MIF 表达与 RSA 发生的关系早期妊娠的胚胎发育和胎盘发生是在相对低氧的环境中进行的, IET TA 等 7研究结果显示, MIFmRNA 和蛋白在妊娠 7 10 周时的绒毛和蜕膜组 织表达水平最高, 在
13、妊娠 11 12 周时降低, 并维持一个较低的水平直到足月。体内外低氧试验研究显示, 绒毛外植体和胎盘低氧均可诱导 MIF 的高表达。詹瑛等 8研究显示, 早期自然流产病人血清中瘦素( LP) 与? ?人绒毛膜促性腺激素( HCG) 水平明显相关, 低氧可诱导 LP 和 MIF 的增加, 但两者之 间是否相关还有待于研究。H CG 可上调子宫内膜间质细胞 MIF 蛋白分泌和 MIF mRNA 的合成, 但其机制仍不清楚。uNK 在人类早期妊娠中起重要作用, 研究表明, 将 uNK 细胞与 MIF 一起培养,MIF 可明显降低 uNK 细胞的溶解细胞活性, uNK 细胞既是 MIF 的来源, 也
14、是 MIF 作用的靶细胞,MIF 通过自分泌和旁分泌作用抑制 uNK 细胞释放细胞毒性穿孔素, 从而发挥其抑制 uNK 细胞溶解滋养细胞毒性作用 9。最新研究显示, 17? ?雌二醇可调节 AT P?结合盒膜传递蛋白 A1( ABCA1) 的表达, 增加胎盘组织中 MIF 的分泌, 从而促进胚胎的 发育 10。本文研究结果表明, 虽然两组病人的绒毛、 蜕膜组织中均有 MIF 蛋白和 mRNA 的表达, 但RSA 组 MIF 蛋白及 mRNA 的表达水平明显低于对照组, 提示 MIF 在早期妊娠维持和胚胎发育中可能起重要作用。3. 3? 早期妊娠妇女血清 MIF 水平对 RSA 的预测 价值目前
15、关于妊娠期 MIF 的血清水平检测报告较少。T ODROS 等 11采用 ELISA 方法检测显示, 子痫前期病人血清 MIF 中位数为 12. 74 ?g/ L, 而正常妊娠孕妇血清 MIF 中位数为 5. 3 ?g/ L。健康未孕女性血清 MIF 水平为 ( 4. 6 ? 2. 3) ?g/ L 12, 而妊娠后血清 MIF 水平为 10. 1 ?g/ L。血清 MIF 水平 在胎儿具有正常染色体核型的先兆流产病人中明显降低 13, 这表明 MIF 在 RSA 的发病机制中起重要作用。本文结果显示, RSA 组病人血清 MIF 水平明显低于对照组, 差异有显著性; 血清 MIF 水平与绒毛
16、和蛻膜组织中 MIF mRNA 和 MIF 蛋白表达水平呈正相关。YAN 等 14在肿瘤免疫逃逸的研究中发现,MIF 可以抑制 T 细胞的活性, 当被伴刀豆球蛋白 A 刺激时, Th2 细胞 MIF mRNA 和蛋白表达水平明显增加。经典的免疫赦免部位眼房水研究显示, 高浓度的 MIF 可以抑制 NK 细胞介导的细胞毒反应 15。RSA 的病因错综复杂, 本研究结果显示, MIF mRNA?412青? 岛? 大? 学? 医? 学? 院? 学? 报47 卷及其蛋白在 RSA 病人绒毛及蜕膜组织中呈低表达, 提示其可能参与了 RSA 的发病, 早期妊娠血清 MIF水平下降与 RSA 相关, 对 RSA 的发生可能起到一定的预测作用。虽然 MIF 的作用机制和信号转导多样, 但因其处于免疫调节、 神经内分泌的枢纽地位, 越来越被认为是预测和治疗RSA 的? 靶点?。 参考文献 1邢修业, 颜军昊, 李媛, 等. 复发性流产与细胞因子基因多态性的研究进展 J . 中华妇
