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1、第 1 页 共 8 页水中水中总总大大肠肠菌群的菌群的测测定定多管多管发发酵法酵法 一原理一原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称 MPN表示。三三仪仪器器(1)高压蒸气灭菌器。(2)恒温培养箱、冰箱。(3)生物显微镜、载玻片。(4)酒精灯、3mm 接种环。(5)培养皿（直径 100mm）、试管（5150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、
2、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。四培养基及染色四培养基及染色剂剂的制的制备备1乳糖蛋白胨培养液：将 10g 蛋白胨、3g 牛肉膏、5g 乳糖和 5g氯化钠加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节溶液 pH 为 7.27.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混匀，分装于试管中，于121高压灭菌器中灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。3伊红美蓝培养基：第 2 页 共 8 页贮备培养基的制备：于 2000mL 烧杯中，先将 20g 琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解。
3、再加 2.0g 邻酸二氢钾及 10g 蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至 1000mL，调节溶液 pH 值为 7.27.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入 10g 乳糖，混匀后定量分装于250mL 或 500mL 锥形瓶内，于 121高压灭菌 15min，贮于冷暗处备用。平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的 2%伊红水溶液（0.4g 伊红溶于 20mL 水中）和一定量已灭菌的 0.5%美蓝水溶液（0.065g 美蓝溶于 13mL 水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌
4、的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。4革兰氏染色剂：结晶紫染色液：将 20mL 结晶紫乙醇饱和溶液（称取 48g 结晶紫溶于 100mL95%乙醇中）和 80mL 1%草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。助染剂：将 1g 碘与 2g 碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至 300mL。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于 30mL 蒸馏水中，临用前再加水稀释。脱色剂：95%乙醇。复染剂：将 0.25g 沙黄加到 10mL95%乙醇中，待完全溶解后，第 3 页 共 8 页加 90mL 蒸馏
5、水。五五测测定步定步骤骤水源水于各装有 5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的 5 个试管中（内有倒管），分别加入 10mL 水样；于各装有 10mL 乳糖蛋白胨培养液的 5 个试管中（内有倒管），分别加入 1mL 水样；再于各装有 10mL 乳糖蛋白胨培养液的 5 个试管中（内有倒管）分别加入 1mL 110 稀释的水样。共计 15 管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于 37恒温箱内培养 24h。平板分离：上述各发酵管经培养 24h 后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基培养基上，置于 37恒温箱内培养 24h，挑选符合下列特征的菌落：a伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽
6、的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。取上述特征的群落进行革兰氏染色：a用以培养 1824h 的培养物涂片，涂层要薄；b将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min 后用水洗去；c滴加助色剂，1min 后用水洗去；d滴加脱色剂，摇动玻片，直止无紫色脱落为止（约 2030s），用水洗去；e滴加复染剂，1min 后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰第 4 页 共 8 页氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初
7、发酵管（瓶）的最典型菌落 13 个，然后置于 37恒温箱中培养 24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表 1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。结果与分析：初发酵实验10ml 原水+5ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基：5 管有产酸产气现象1ml 原水+10ml 普通浓度乳糖蛋白胨培养基：2 管有产酸产气现象，1 管有产酸现象1ml1：10 稀释水样+10ml 普通浓度乳糖蛋白胨培养基：1 管有产酸产气现象复发酵实验：10ml 原水+5ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基：5 管有产酸产气现象1ml 原水+1
8、0ml 普通浓度乳糖蛋白胨培养基：2 管有产酸产气现象1ml1：10 稀释水样+10ml 普通浓度乳糖蛋白胨培养基：1 管有产酸产气现象结论：从最可能数（MPN）表中查检验结果 521，得知 100mL水样中的总大肠菌群数为 70 个，故 1L 水样中的总大肠菌群数为第 5 页 共 8 页7010=700 个。对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应做110、1100、11000 或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。如果接种的水样量不是 10mL、1mL 和 0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得 MPN 指数，再经下面公式换算成每 100mL 的 MP
9、N 值：)()(10 mLmLMPNMPN一一一一一一一一一一一附表附表 1 大大肠肠菌群菌群检检数表数表接种水样总量 300mL（100mL2 份，10mL10 份）100mL 水量的阳性瓶数01210mL 水量的阳性管数1L 水样中大肠菌群数1L 水样中大肠菌群数1L 水样中大肠菌群数01230附表附表 2 最可能数（最可能数（MPN）表）表（接种 5 份 10mL 水样、5 份 1mL 水样、5 份 0.1mL 水样时，不同阳性及阴性情况下 100mL 水样中细菌数的最可能数和 95%可信限值）出现阳性份数95%可信限值出现阳性份数95%可信限值10mL 管1 mL0.1 mL每100m
10、L 水样中细菌下限上限10mL 管1 mL0.1 mL每100mL 水样中细菌下限上限第 7 页 共 8 页管管数的最可能数管管数的最可能数00001111123344444440012001120230011122010001010010010120122242446651717131717212622260.50.50.50.50.50.50.50.50.577117111515151346463146466378677822222333335555555550112300112222333344101000101001201230177991281111141449709479110140180130170112231224417232825313744354317172121281925253434130170220190250310500300190第 8 页 共 8 页44455555533400011101001201227333423344333466355355797991112711151116218093937089110931201505555555554445555552340123452202803502403505409201600240057901206812018030064070085010007501000140032005800
