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1、体外连续培养人口腔粘膜角化细胞体外连续培养人口腔粘膜角化细胞中华口腔医学杂志 2000年第6期第35卷 论著作者：周海文 周曾同 商庆新 曹谊林单位：周海文 周曾同（200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔内科） ；商庆新 曹谊林（上海第二医科大学组织工程研究中心上海市组织工程重点实验室）关键词：细胞培养；口腔粘膜；角蛋白【摘要摘要】 目的目的 建立一个稳定的人正常口腔粘膜角化细胞体外培养体系。方法方法 取正常口腔粘膜,经 Dispase 及胰蛋白酶消化获取细胞，采用无血清培养液进行原代及传代培养，并进行形态学观察和角蛋白免疫组化染色等一系列细胞定性研究。结果结果 获取的细胞为单一上皮细胞
2、；细胞可连续传45代，成活3050 d；细胞呈铺路石状，为上皮细胞的典型形态；电镜下见细胞具有丰富的张力丝和桥粒等特征性超微结构；角蛋白免疫组化染色阳性。结论结论 应用 Dispase 酶及无血清培养液，在无3T3细胞的条件下可成功进行人正常口腔粘膜角化细胞连续传代培养。Serial cultivation of normal human oral keratinocytesZHOU Haiwen, ZHOU Zengtong,SHANG Qingxin, et al.(Department of Oral Medicine, School of Stomatology， Shanghai S
3、econd Medical University, Shanghai 200011，China)【Abstract】 Objective To establish a method of culturing normal human oral keratinocytes. Methods Specimens obtained from healthy humans undergoing oral surgery were dissociated by Dispase and trypsin into a single cell suspension. The cells were grown
4、in serum-free medium. Morphological characteristics were studied under light microscope and electron microscope (EM). Cytokeratins were showed by immunohistochemistry.Results The cells could be maintained in culture up to 45 passages, or 3050 days. EM revealed that there were desmosomes and tonofibr
5、ils in the culture cells. The cells showed positive staining for cytokeratin antibody.Conclusions The culture technique for growing normal human oral keratinocytes has been established.【Key words】 Cell culture； Mouth mucosa； Keratin多年来，我们依托金黄地鼠为动物模型对口腔粘膜癌前病变的发生、发展及阻断进行了大量的研究，取得了一定的成果。但以动物模型作为研究手段尚存在
6、一定缺陷，如实验周期长、 费用高、 无法排除人与动物之间的种属差异等，影响研究成果向人体的临床转化。与动物模型相比，细胞培养体系易于控制周围的环境条件，避免了整体实验中神经体液的综合调控因素及多种细胞之间的相互作用，研究样本可达到相对均一性，实验周期短、重复性好，便于用现代化手段进行分析，无需使用大量的活体动物，研究经费相对经济1,2。因此，我们设想建立一个稳定的人类正常口腔粘膜角化细胞体外培养体系，以期为研究粘膜上皮癌变过程及阻断和治疗提供实验性的新手段。材料与方法材料与方法一、 原代及传代培养无菌条件下取健康人拔智齿时切除的龈粘膜或口腔整复术中切除的口腔粘膜（年龄50岁） 。PBS 冲洗，
7、除去粘膜下组织，剪成约5 mm5 mm 的小块，加入0.25% Dispase(美国 GIBCO),4 消化1618 h，将表层上皮及上皮下层分开。上皮层加入混合消化液中(0.25%胰蛋白酶0.02% EDTA=11)，37 振荡消化510 min，加小牛血清终止消化，用吸管吹打成单细胞悬液。洗涤，弃上清，加入角化细胞培养液(美国 GIBCO)，红细胞计数板计数。以0.25104个细胞/cm2的密度接种于35 mm 直径的塑料培养皿中(丹麦 NUNC)，置37 5%CO2饱和湿度细胞培养箱(美国 NAPCO)中培养。第3天首次换液，以后每2 d 换液1次。 细胞长至培养皿的80%时传代。用混合
8、消化液，37 消化35 min，镜下见胞质回缩即终止消化。以12或13接种入新培养皿。二、 形态学观察用相差显微镜每日动态观察细胞形态变化及生长增殖情况；用光学显微镜观察长有细胞的玻片，HE 染色。三、 超微结构观察取长有细胞的玻片，常规操作，扫描电镜(SEM-520)观察；另将生长成片的细胞从培养皿中揭下，透射电镜(JEM-1200EX)观察2。四、 免疫组化染色取长有细胞的玻片，95%丙酮固定20 min，用广谱单克隆角蛋白抗体(美国 SIGMA)及LSAB 免疫组化试剂盒(美国 DAKO)，按说明操作。设立实验组、阳性对照组(正常口腔粘膜组织石蜡切片)、空白及阴性对照组（成纤维细胞） 。
9、结果结果一、 细胞生长特性整个上皮细胞生长期间为单一的上皮细胞,无成纤维细胞混杂生长。细胞可传45代，成活3050 d。1 原代：刚获取的细胞形态呈多样性，为多角形扁平细胞、体积较大的球形细胞和体积较小的球形细胞。后者胞浆均匀明亮，轮廓清晰光滑，为正常细胞。细胞接种后3296 h 贴壁，为折光性强的圆形细胞。随后细胞逐渐伸出短小伪足，胞质展开，折光性减低。完全伸展的细胞呈扁平多边形，胞核清晰，核仁2个，细胞大小是伸展前的23倍。此时核分裂像少见。接种 5 d 后细胞加速增殖，核分裂像多见，细胞数量明显增多。细胞逐渐生长融合成片，呈大小均一的铺路石状。培养2周左右细胞接近融合(图1)。2 传代：
10、传代细胞24 h 左右即可贴壁伸展，第2代细胞形态与原代相似。从第3代起出现个别体积较大的“巨细胞”。传代次数增加， “巨细胞”数量增加。第5代，细胞以“巨细胞”为主，且形态逐渐由多边形变得不规则，有的细胞伸出长长的伪足与邻近细胞相接。细胞界限模糊，胞核散大，胞内出现细小空泡及黑色小颗粒，细胞增殖减慢甚至停滞，最后从皿底脱落死亡。3.分化：在培养过程中细胞还表现出一定的分化现象，在低密度培养时尤其明显。上皮细胞克隆在向外生长扩张的同时，从克隆中心开始出现分化(约在接种后2周)。克隆中心处首先出现“峰与谷结构”(峰：层次较多的细胞丘；谷：层次相对较少之处)，表层散在折光性强的同心圆状角化珠，并见
11、鳞屑形成。分化由中心向外周推进，克隆最外层仍为有增殖能力的单层细胞。二、 细胞鉴定1 形态学：细胞为多角形，铺路石状，核大，无异常核分裂像，符合上皮细胞特征。2 超微结构：透射电镜下，胞核大，卵圆形；胞质内见正常细胞器，含大量的张力纤维，网状或束状排列；细胞之间有丰富的桥粒结构(图2)。扫描电镜下见细胞呈镶嵌状排列，表面可见微绒毛和胞浆皱褶。偶见胞浆回缩的球形细胞，表面微绒毛丰富(图3)。3. 免疫组化染色 ：实验组：角蛋白染色阳性，胞浆黄棕色，高倍镜下呈细丝网状，衬染的核呈蓝色（图4） 。阳性对照组：上皮全层染色阳性，胞浆黄棕色；阴性及空白对照：阴性。讨论讨论体外培养的口腔粘膜角化细胞寿命较
12、短，一般细胞可传24代，最长传79代3，4，国内报道极少且仅限于原代培养5。本实验中细胞可传45代，为进一步的研究奠定了基础。 角化细胞是一种需复杂营养的，在一般合成培养基中不易生长的细胞。虽然近20年来，国内外相继开展了口腔粘膜角化细胞体外培养的研究，但是如何建立一个稳定的体外培养体系仍是人们研究的热点。一、培养方法获取原代细胞有组织块培养及消化法2种。前者简单易行3，6，7。我们早期用该法，可传34代。但由于组织块的原代细胞培养时间较长，且并非每一块都有细胞萌出，细胞传代次数和最终获取的细胞较少。因此本项实验采用消化法。Dispase 是一种快速、有效、作用温和的分离上皮与真皮的中性蛋白酶
13、。在分离上皮时，它作用于基底膜，选择性地分解纤维连接素和型胶原，而保存上皮细胞活力及细胞连接8。与胰蛋白酶相比，它只是将上皮层分离而不分解单个细胞，可在保留上皮细胞活力与连接的同时将上皮层与上皮下层自基底膜处完全分离，从而可得到单一的上皮细胞。上皮层因细胞间质较少，适于用胰蛋白酶消化分离1,2。二、培养体系1 3T3细胞：国外培养角化细胞多采用3T3细胞作为滋养层7，9，10。由于经酶消化获取的角化细胞贴壁生长困难，而3T3细胞可促使其贴壁并抑制成纤维细胞生长而得到广泛应用。但3T3细胞无疑作为一种混淆因子影响后继应用研究结果的准确性。为此，人们采用了其他的角化细胞培养方法，如在培养皿底部涂布
14、培养基质4 ，选择培养基中最佳的钙离子浓度，采用无血清培养液并添加最佳组合的营养成份3，4，11。本实验即采用无血清培养液，在无3T3细胞的条件下成功培养，不仅简化了实验，而且进一步表明3T3细胞不是角化细胞成功培养的必需条件，关键在于获取的原代细胞本身的活力。2培养基：角化细胞需复杂营养，在培养体系中需提供较高的胎牛血清浓度、较高的种植密度及多种辅加成份。传统培养使用含10%20%的胎牛血清培养液。血清除了提供细胞生长的营养成分外，还能促进细胞 DNA 合成，并含有细胞增殖所必需的生长因子。但血清成分复杂，含有一定的细胞毒性物和抑制物，影响某些细胞功能的表达，因而现在许多学者都在寻求无血清培
15、养液1，2。 国外报道,人类口腔粘膜上皮细胞应用含血清培养液一般可传24代；Oda 等3，4采用无血清培养液，并加入多种营养成分，如 EGF、胰岛素、牛垂体提取液、氢化泼泥松、转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸、腺嘌呤、霍乱毒素等，使细胞传至79代。国内报道极少且仅限于原代培养5。本实验采用成品无血清培养液角化细胞培养液，其中含胰岛素、上皮细胞生长因子等。细胞增殖较快，可达 45代。三、 细胞鉴定本实验通过形态学、超微结构观察及角蛋白免疫组化染色进行细胞定性研究。上皮细胞的典型形态为多角形，如铺路石状密集排列，胞核大，含2个核仁。生长良好时，占优势的为小的基底样细胞，大小均一。其中散布较大的不均一细胞。
16、胞浆含大量的张力原纤维束，细胞间的桥粒连接是上皮细胞的典型结构3，4，6。角蛋白是上皮细胞主要的结构蛋白和分化的标志产物，亦是其特异性表达蛋白，应用免疫组化方法检测角蛋白抗体阳性即可证实所培养细胞为上皮细胞2-4，6。口腔粘膜上皮细胞体外培养具有潜在重要的生物学及临床意义。它不仅为研究口腔粘膜上皮癌变过程及阻断、治疗提供实验性的新手段，也为进一步研究口腔粘膜分化、口腔病理生理、毒理学及癌发生机制等提供良好的实验体系12，13，而且为人类组织工程化口腔粘膜构建奠定了基础，对口腔粘膜组织缺损修复具有重要意义3，14。但是，口腔粘膜上皮细胞最佳培养条件尚需进一步探索，以便能得到寿命更长、更具扩增能力的细胞株。图1 相差显微镜观察口腔粘膜上皮细胞原代，接种后第15天，细胞融合成片，如铺路石密集排列；细胞生长良好，周界折光性强（100）图2 透射电镜观察，A：细胞之间的桥粒结构，可见张力丝进入桥粒的附着斑中；B：胞浆内丰
