《表达PR1a和Osmotin基因的马铃薯植株的获得及其对晚疫病的抗性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《表达PR1a和Osmotin基因的马铃薯植株的获得及其对晚疫病的抗性分析（71页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国农业大学博士学位论文表达PR1a和Osmotin基因的马铃薯植株的获得及其对晚疫病的抗 性分析姓名：陈茹梅申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：裘维蕃;李怀方2001.5.1摘要以珊西烟草( f c D 妇H 口，D 6 口c “ x m j n c ) 基因组D N A 为模板，通过合成5 端和3 -端一对特异引物，利用P c R 扩增得到了完整的病程相关蛋白P R l a 蛋白基因，克隆到口R L G E M c 3 质粒上，进行了序列测定。同时。利用本实验室原有的o s m o t i n 蛋白基因，分别将其克隆到p B l 5 2 5 质粒上基因表达盒内，获得了两个基因的植物
2、高效表达载体：p B P和p B c 5 。将构建在p B P 和p B c 5 上的P R l a 和O s m o t i n 基因表达盒切下。构建到双元载体p B I N P L u s 上，得到重组双元载体p B I P 和p B Ic 5 。转化农杆菌g r 0 6 d c 地r f 堋r 堋嘎廊c f g 脚)L B A 4 4 0 4 感受态细胞，得到两个分别含有重组双元载体p B I P 和p B I c 5 的农杆菌菌株。用这两个菌株对三种马铃薯品种A t l a n t i c 、D e s i r e e 和M i r a 进行叶盘法转化。农杆菌感染后的马铃薯的叶盘和茎段
3、外植体，在选择性培养基上诱导愈伤组织和芽的分化，产生不定芽，形成再生植株。对得到的1 0 5 株卡那霉素抗性再生植株进行P c R 检测，转化P R l a 蛋白基因的植株阳性率为8 0 ，转化O s m o t i n 蛋白基因植株的阳性率为3 6 1 ，双基因的阳性率为1 2 3 。对P c R 用性植株进行s o u t h e m - B I o t 检测，确定外源基因己整合到马铃薯染色体上。对转基因植株进行w b s t e m 分析，表明外源基因在马铃薯中得到表达。厂 ，( 采取离体叶片室内测定法，以病斑生长速率( L e s i o nG m w 出R a t e ，L G R
4、) 和产孢量( s p o m l a t i o nc 印a c 时，s c ) 为指标，结合统计学分析，对转基因植株的抗病性进行了鉴定和分析。从4 9 株转基因植株中鉴定出3 0 株转基因抗病植株。转基因植株的抗性表现为：( 1 ) 延缓病斑生长速率，转0 s m o t i n 的转基因植株中，表现最好的两株D 1 3 为0 9 2 7 ，D 4为0 9 8 7 ；转P R l a 的转基因植株中D 8 为0 7 7 9 ，D 7 为O 9 3 3 ：转双基因的植株D 9 为0 8 1 8 D 5 l 为1 0 7 0 ；对照的L G R 为1 5 8 8 。( 2 ) 降低病菌产孢量。
5、对照植株产孢量为1 2 0 0 8 ；转O s m o t i n 的转基因植株中，表现最好的两株D 4 为6 6 8 2 ，D 1 6 为9 6 0 3 ；转P R l a 的转基因植株中表现最好的两株D 4 8 为9 5 6 ，D 4 9 为2 2 3 4 ；转双基因的植株中表现最好的两株D 1 4 为4 3 4 3 D 2 0 为4 9 9 8 。转基因植株的抗病性鉴定结果证明：组成型表达P R l a 基因能赋予马铃薯植株抗病性，同时也验证了o S m o t i n 蛋白胞外分泌赋予转基因植株对晚疫 j 病的抗病性。寸iA b s t r a c tL a t eB I i g h
6、tc a u s e db yo o m y c e t e 尸砂f 印厅腩D ，口啦幻m 删( M o n t ) d eB a r yi st h e。m o s td e v a s t a t i n gd i s e a S ea n di sc o n s i d e r e da so n eo ft h em o s ti m p 嘣a n tc r o pd i S e a s eb yF A O T h ea n n u a ll o s sr e s u l t e d 疗o mo c c 咄n c eo fl a 把b l i g h tr e a c h e d1b
7、i l l i o nU SD o l l a r si nC h i n a Se 、r e r a lt i m e sm o r em o n e yi ss p e mo n 觚g i c i d ea p p l i c a t i o ni n o r d e rt oc o n t r o ll a t eb l i g h t T h i st h e s i sf o c u s e so ng e n e t i ce n g i m e r i n go f1 a t eb l i g h tr e s i s t a I l c e T h eg e n e s u s
8、 e dw e r eP R l aa n dO s m o t i ng e n ef b mt o b a c c o ( i c D f f 删口f D 6 口c “州x a I l t h i n c ) P R lag e n e ，a Sa m p l i f i e db yP C R n l c ni tw a sc I o n e di n t op I a s m i dp G E M R L C 3a I l ds e q u e n c e di n 也i se x p e r i m e n t O s m o t i ng e n ew a s 锄p l i f i
9、 e da I l ds e q u e n c e di np r e v i o u se x p e r i m e m B o t hg e n e sw e r ec o n S m l c t e di n t og e n ee x p r e s s i o nc a S s e n eo fp l a s m i dp B l 5 2 5r e s 口e c t i v e ly T h eg e n e s 、v e r ed r i v e nb yd o u b l e3 5 Sp r o m o t e r so fC a M v T h e ng e n ee x
10、_ D r c s s i o nc a s S c t t e sw e r ed i 辨s t e db y 胁H 矾a r I dZ 1 c D RI ，a n dt 、v oc a s s e t t e s 、v e r e c o n s m l c t e di n t ot h eb i r 扭r yv e c t o rp B I N P L U S T h er e c o m b i n a I l t b i n a r yv e c t o r sw e r ct r a n s f e r r e di n t oc o m p e t e mc e l l so
11、f4 舯6 口c 陀r f “mf “m e 向c f e 以sL B 缸1 4 0 4 r w o4 ，“m 8 向c 把珊s 仃a i n sh a r b o r i n gP R l ag e n ea 1 1 dO s m o t i ng e n e 、v e r eo b t a i n e d T h r e ep o t a t Oc u I t i v a r s ，D e s i r e e ，A t l a r l t i ca I l dM i r a ，w e r ec h o s e na ss t a nm a t e r i a l s f o r 仕a n
12、s f o 肌a t i o n G e n e t i ct 阳n s f 0 咖a t i o nw a sp e r f 0 m l e db y 爿，“m e ，白c f P ，坫一 m e d i a t e d1 e a f - d i s c 仃a I l s f o H n a t i o nm e m o d T m s f o 胁e dp o t a t oe x p l a n t s ：1 e a fd i s co r s t e mi n t e m o d e s 、v e r eD l a c e do ns e i e c t i v em e d i 哪t
13、oi n d u c ec a n u sa n da d v e n t i t i v es h o o t s 1 0 5f e 窖e n e r a t i o np l a n t sw e r eo b t a i n e d 廿l r o u g l l7t r a n s f b r n l a t i o ne x p e r i m e m s P C Ra S s a yO f r e g e n e 嘶o np l a n t si n d i c a t e dt 1 1 a t ：P R l ag e n ep o s i t i v ep l a n t sw e
14、 r e 8 0 o fa l lr e g e n e r a t i o np l a n t s O s I T l o t i ng e n ep o s i t i v ep l a n t s 、v e r e3 6 1 P o s i t i v et r a n s g e n i cp l a I l t sw i t ht w og e n e s 、v e r e1 2 3 S o u t h e m _ b l o ta n a l y s i so ft m s g e n i cp l a l l t si n d i c a t e dt h a tP R l a
15、a r l dO s m o t i ng e n ei n t e 蓼a t e di n t oc h r o m o s o m eo fp o 协t o W b s t e m - b l o ta 1 1 a l y s i so f 廿a I l s g e n i cp l a n t si 1 1 d i c a t e dt t l a tP R l aa n d0 s m o t i ng e n ee x p r e s s e di nm ep o t a t 0p l a n t S T h e1 a t eb l i g 娜r e s i s t a I l c e
16、i n 仃a n s g e l l i cp l a n t Sw a st e s t e du s i n gar a c eo fA lm a t i n gt y p eb a S e d0 nl l l e1 e s i o ng r o w mr a t e ( L G R ) a I l ds p o m l a t i o nc 印a c 时( S C ) o f P 厅y r D 砌纳o r 口加店J 以，岱z o o s p o r c so nd e t a c h e dl e a v e si nl a b o r a t o r y IT h eL G Ra n dS Cw e r es t a t i s t i c a l l ya n a l y z e d ： T h i r t yp l a n t se x l l i b i t e dr e s i s t a I l c et oP 以砌胁
