《HeNe激光及联合黄芪注射液对骨髓基质细胞VCAM1、ICAM1表达影响的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HeNe激光及联合黄芪注射液对骨髓基质细胞VCAM1、ICAM1表达影响的实验研究（32页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、内蒙古医学院硕士学位论文He-Ne激光及联合黄芪注射液对骨髓基质细胞VCAM-1、ICAM-1表 达影响的实验研究姓名：王彩霞申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：崔明玉20080501内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)英文缩略语表内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)噬细胞系统具有激活作用。随着激光技术的发展，低强度激光在生物医学领域的应用不断扩大，临床医学利用低强度激光的生物刺激效应调整机体的免疫系统、神经系统、血液循环系统和组织代谢等功能。大量临床应用表明，低强度激光能促进免疫反应，增强巨噬细胞吞噬功能，改善全身状况，小剂量有累积作用。
2、实验证明，低强度激光对成纤维细胞，胸腺细胞、内皮细胞、造血细胞、神经细胞、软骨细胞、成骨细胞等多种细胞均有不同程度的增殖效应3 4 1 。但低强度激光对骨髓造血微环境的影响尚未见报道，本课题采用不同剂量( 4 2 0 J 甜、2 7 5J 甜) H e N e 激光体外照射小鼠，观察骨髓基质细胞表面、，C A M 一1 、I C A M 一1 表达，探讨低强度H e N e 激光调控造血的机理，为激光的临床应用提供实验依据o。黄芪是补气类中药。近年来，大量的研究发现黄芪具有调节机体免疫力、调节骨髓造血等功能。多数研究集中在骨髓造血细胞方面，对基质细胞的研究甚少。本课题采用低强度H e N e
3、激光照射小鼠对其骨髓基质细胞进行培养，并在培养基中加入黄芪注射液，检测骨麓基质细胞表面V C A M 一1 、I C A M 一1 蛋白表达，来探讨黄芪促进造血的机制，为黄芪注射液应用于临床提供实验依据o1 材料与方法1 1 实验材料1 1 1 实验动物：4 6 周龄健康雄性昆明小鼠，清洁级，体重1 8 2 9 ，购自内蒙古大学动物中心o1 1 2 试剂F I T Ca n t i m o u s eC D l 0 6 ( V C 州一1 )P Ea n t i m o u s e 5 4 ( I 洲一1 )黄芪注射液D M E M 低糖细胞培养基胎牛血清胰蛋白酶M T T二甲基亚砜1 1 3
4、 基本溶液配制细胞培养液制备深圳晶美生物制品有限公司深圳晶美生物制品有限公司成都地奥九泓制药厂G i b e o U s A 公司天津市灏洋生物制品科技有限责任公司日本进口分装，上海化学试剂公司S i g m a 公司S i g m a 公司内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)参照D e x t e x 培养体系，细胞培养液以D M E M 细胞培养基为基础，内含1 0 0 U r r d 青霉素、1 0 0 U m l 链霉素；P H 在7 2 - 7 4 之间；D I 皿、M 培养基按说明书配制，滤膜过滤除菌，放置至多个1 0 0 m l 无菌瓶内，一2 0 保存备用。应
5、用前每瓶加入适量经过灭活的胎牛血清o4 保存o磷酸盐缓冲液( P B S )N a C L 8 0 9 ；K C L 0 2 9 ；N a 2 H P O + 1 2 H 2 01 5 6 9 ；K H 2 P 0 40 2 9 0 加超纯水至1 0 0 0 r r d ，过滤消毒o4 保存o4 多聚甲醛4 9 多聚甲醛溶于1 0 0 m l P B S 液中，放置于6 0 1 2 水浴箱中搅拌，并用N a O H 调P H 值为7 2 7 4 ，使得多聚甲醛溶解，用0 2 u m 滤器消毒，放置到室温后使用，4 冰箱保存o1 1 4 主要仪器激光仪电热恒温鼓风干燥箱超声波清洗机二氧化碳细胞培
6、养箱酶标光度计流式细胞仪超净工作台倒置显微镜离心机图像采集分析仪1 2 方法。+可一I B 2 BD H G 一9 0 7 0 AK S 一5 0 0 E IH F 9 0 H F 2 4 0R T 一2 1 0 0 CE p i c s X L I I 。S W c J 一2 F DA E 一2 1 聊A 一喝C X 一4 1南京激光仪器厂上海一恒科学仪器有限公司宁波海曙科生超声设备有限公司上海立申科学仪器有限公司深圳雷杜生命科学股份有限公司美国B e c k m a nC o u l t e r 公司上海博讯实业有限公司美国O l y m p u s 公司长沙湘仪离心有限公司日本1 2 1
7、 实验动物分组：昆明小鼠3 0 只，随机分为3 组，每组1 0 只oA 组( 对照组)B 组( 2 7 5J c m 2 激光组)C 组( 4 2 0 J 吼2 激光组) 1 2 2 不同剂量的H e N e 激光照射小鼠模型的建立将小鼠股骨部剔毛后四肢固定于鼠台，采用H e N e 激光器，波长为6 3 2 8 r i m ，光斑直径为1 0 c m ，照射距离为1 0 c m oB 组、C 组小鼠分别用剂量为2 7 5J 锄? 、4 2 0J o内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)激光垂直照射小鼠的股骨头，左右股骨每日各照射5 m i n ，共照射1 0 天。最后一次照射
8、后，2 4 h 取材作培养o1 2 3 小鼠骨髓基质细胞体外培养( 参照D e x t e r 等【5 】创立的全骨髓贴壁细胞分离筛选法)1 2 3 1 小鼠骨髓基质细胞分离与原代培养A 、B 、C 组小鼠均采用颈脱臼法处死，其中B 、C 组是在最后一次照射后2 4 小时处死o7 5 酒精浸泡约5 分钟o用剪刀和镊子在无菌条件下分离出双侧股骨与胫骨，P B S 液冲洗二次后剪除骨两端，再以P B S 液，7 号针头反复冲洗髓腔，至骨发白o过4 号针头制成单个核细胞悬液，8 5 0 r m m 离心1 0 r a i n ，去除上清液，用含2 0 胎牛血清的D M E M 培养液反复吹打重悬细胞
9、，调整细胞浓度为3 4X1 0 6 “接种于2 5 锄2 一次性培养瓶中o置3 7 、5 c c h 、饱和湿度c c h 培养箱中培养。4 天后弃上清，P B S 液洗二次，去除悬浮细胞o加人D M E M 完全培养液，以后每二天换液一次o1 2 3 2 小鼠骨髓基质细胞传代培养待小鼠骨髓基质细胞长满瓶底时，弃上清，P B S 液洗涤2 3 次。加入0 2 5 胰酶，置3 7 、5 c c h 、饱和湿度0 0 生培养箱中孵育5 1 0 分钟o待细胞开始变圆后加入含2 0 胎牛血清的D M E M 培养液终止消化o收集消化后的细胞悬液，1 0 0 0 r m m 离心1 0 m i n o充
10、上清，加入完全培养液，以1 ：2 的比例传代培养。F 2 代细胞用于实验o1 2 4 小鼠骨髓基质细胞的镜下观察：1 2 4 1 倒置显微镜观察：自原代培养开始观察不同时间细胞生长特点和形态变化1 2 4 2H E 染色光学显微镜观察( 1 ) F 2 代细胞9 5 乙醇固定3 0 m i n( 2 ) P B S 清洗一遍1 2 m i n( 3 ) 苏木精染色2 0 m i n内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)( 4 ) 去掉染液自来水中漂洗( 5 ) 伊红染色6 7m i n( 6 ) 自来水中去伊红液( 7 ) 8 0 乙醇中浸人即取出( 8 ) 1 0 0 乙醇中
11、5r a i n( 9 ) 二甲苯I5r a i n( 1 0 ) 二甲苯5m i n( 1 1 ) 树胶封片，光学显微镜下观察1 2 4 3 透射电镜观察F 2 代培养9 天的B M S C s 用P B S 洗3 次，0 2 5 胰蛋白酶消化，3 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，用3 戊二醛固定后送电镜室，透射电镜观察o1 2 5M T T 法检测黄芪注射液促进小鼠骨髓基质细胞增殖的最佳浓度微量滴定( M i c r o t i t r a t i o nA s s a y ；用A 仉T ) 【6 是一种用相对少量细胞检测不同的试剂方法oM T T 为黄色水溶性四唑( T
12、 e t r a z o l i u m ) 染料，能被活细胞还原，而死细胞不能，形 成紫色的不溶于水的产物( F o r m a z a n ) o 肼( 四甲基偶氮噻唑蓝) 法是一种测定细胞增殖和衰亡的快速比色法，其原理是活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶可使底物噻唑蓝 ( 肼) 转化成紫色结晶化合物，后者可被D M S O 溶解，根据颜色变化的深浅，用酶标仪测O D 值，可反映细胞线粒体的功能。一 接种细胞】( 1 ) 0 2 5 胰蛋白酶消化A 组( 对照组) 8 0 一9 0 汇合F 1 代培养细胞，收集于含有血清的生长培养液中；( 2 ) 8 5 0 r r o a n 离心5 m i
13、n ，弃上清，重悬于生长培养液中，计数；( 3 ) 调整细胞悬液浓度，以每孔1 1 0 4 1 m 1 个细胞接种于9 6 孔板，每孔体积2 0 0 一。边缘孔用无菌P B S 填充。置3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养，倒置显微镜下观察，待细胞贴壁长成单层后换液。 ( 4 ) 加入黄芪注射液五个不同浓度，删d 、删珊、删耐、8 0 唰埘、1 0 0 0 焰J m l 。空白对照组与试验组平行不加细胞只加培养液，每孔体积2 0 叫，每组浓度设6 个复孔o( 5 ) 置3 7 “ C 、5 0 3 2 、饱和湿度的培养箱培养4 4 小时，加M a m o u t 孔，继续培养4小
14、时吸去各孔培养液。加入1 5 0 d 二甲基亚砜( D I 儿S 0 ) ，快速振荡1 0 r a i n 后，在酶联检测内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)仪上测定4 9 0 衄处O D 值，记录结果o1 2 6 流式细胞术( f l 佣锣衄n e t 可，F C M ) 检测不同剂量的H e N e 激光联合黄芪注射液对小鼠骨髓基质细胞的影响F M 【7 】是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞表面标志( 抗原或受体) 进行快速，精确分析和自动检测，并可对不同类型细胞进行分选和收集。R 、M 还可对同一细胞的多种参数( 如D I 妊、融蛆、蛋白质和细胞体积等) 进行
15、多信息分析。将A 组( 对照组) 、B 组( 2 7 5J 甜激光组) 、C 组( 4 2 0 J c I l l 2 激光组) F 2 代8 0 一 9 0 融合的培养细胞分别加入浓度为6 0 0 u d “黄芪注射液( 肼法检测的最佳浓度) ，分别标记为m 组( 对照组+ 黄芪注射液) 、B 1 组( 2 7 5J 锄2 激光组+ 黄芪注射液) 、C 1组( 4 2 J 锄? 激光组+ 黄芪注射液) ，置3 7 、5 C Q 、饱和湿度的培养箱中培养4 8 小时，用流式细胞术检测A 、B 、C 、m 、B 1 、C 1 组I Q 蝴一1 、v I 弘M 一1 蛋白表达量oA 、B 、C 、
16、m 、B 1 、C 1 组细胞P B S 洗二次，0 2 5 胰酶消化；1 5 0 0 r m 访离心5 r n j n ，弃上清液，收集底部细胞；。加4 多聚甲醛1 1 1 1 l ，充分混匀后移人经高压消毒的E P 管中固定，4 保存；取上述细胞悬液，加入新鲜稀释的F I T Ca n t i _ m o l l C D l 0 6 ( 、厂C A M 一1 ) 、P E 锄t im o l l s e 5 4 ( I C 枷一1 ) 单克隆抗体，4 孵育3 0 曲i葫兰羹霎薹薹羹霪雾蓁襄冀性和羹鳃；鞋张聪翳；醐鲥美黏拦蚓；薹薹塑耋蓁霎恭铿羹窆毫茎整壁誉。喜；霉。亘瑁凛派等诵 羹鼋妇黧黧霎，藿萄捌儒掌；葡薹霉囊饿i 臻澄牙烂匙垫
