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1、内蒙古医学院硕士学位论文7-酮基胆固醇-9-羧基壬酸酯诱导THP-1细胞分化中单核细胞趋 化蛋白-1及清道夫受体的表达姓名：魏明琳申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：闫晓红;刘庆平20080501缩略语词汇表内蒙古医学院学位论文原创性声明郑重声明：本人所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行研究所取得的研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文内容不包含其他个人或集体已经公开发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人学位论文与资料若有不实，愿意承担一切相关的法律责任。论文作者签名蕴鲤雏一知苫年月日学位论文版权使用授权书本
2、人完全了解学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。学院享有发表、复制、查阅、借阅及申请专利等权利。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时本人保证：毕业后发表、使用学位论文以及结合学位论文研究课题再撰写的文章，作者署名单位一律为内蒙古医学院。论文作者签名趣驾准山暑年月五日指导教师签名上概江3 回g年月乙日7 一酮基胆固醇一9 一羧基壬酸酯诱导T H P 一1 细胞分化中单核细胞趋化蛋白一1 及清道夫受体的表达动脉粥样硬化( a t h e 黜l e r O i s ，A S ) 是涉及大中动脉的慢性进行性疾病。可能引起斑块
3、破裂、血栓形成及局部缺血性心脏病，发病率与死亡率居于疾病前列，严重危害人类健康。迄今，对A S 的发生过程基本有了清楚的认识，但发病机制尚未完全明了。近年越来越多的证据表明：血中过多的氧化低密度脂蛋白( o X i d 捌l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，o x U ) L ) 参与了A S 的发病机制。流行病学研究认为亚油酸是低密度脂蛋白 ( h vd e n s i t yl i p o p r o t e i n ，U ) L ) 中主要的多聚不饱和脂肪酸，主要以胆固醇酯形式存在。在U ) L 氧化后期，7 一酮基胆固醇一9 羧基壬酸酯(
4、7 一k e 妣h o l e S t e r y l 9 一c a r b 0 X y n o n a n O a t e ，o x L 遮一1 ) 是氧化胆固醇亚油酸盐的最主要成分uJ 。因此，了解o x L i g 一1 在A S中的作用有重要的意义。A s 是一种包括细胞浸润、平滑肌细胞增生、细胞外基质增加及血栓形成等多种病理过程的慢性炎症疾病。其中，外周血单核细胞粘附于血管内皮细胞并迁入内皮下间隙，摄取脂质转化为泡沫细胞是A s 形成的重要早期事件 2 】，在此过程中趋化因子发挥极其重要的作用。单核细胞趋化蛋白1 ( m o n O c y t ec h 咖t t r a c t a
5、 J l tp r o t e i n 一1 ，M C P 一1 ) 是招募单核细胞进入血管壁的重要趋化因子。大量研究表明单核细胞的趋化主要由M C P一1 来实现，M C P 一1 除趋化单核细胞外，对平滑肌细胞也有趋化、增殖的作用，并促进转录因子( T F ) 生成，从而直接或间接地参与了A S 的形成【3 Jo众所周知，外周血单核细胞迁入动脉内皮下间隙，分化成为巨噬细胞是动脉粥样硬化发生的早期事件，有证据表明，巨噬细胞通过清道夫受体途径，摄取o X U ) L ，导致细胞内大量胆固醇酯积聚是泡沫细胞形成的主要机制 4 】o 清道夫受体( S c a v e n g e r ，S R )
6、最初是由G b l d s t e i n 等在巨噬细胞上确认，因其能结合化学修饰性脂蛋白，尤其是氧化或乙酰化L D L 而得名。清道夫受体是一类主要位于巨噬细胞表面的糖蛋白，至少存在6 个不同类型共计1 5 个亚型【5 】。其中与A S 关系密切的是清道夫受体B 类中的C D 3 6 和清道夫受体D 类中的C D 6 8 。C D 3 6 具有配体结合性质，C D 3 6 可以结合到C u 2 + o X U ) L 、A c U ) L 或阴性磷脂上；同时发现C D 6 8 也能够结合o x L D L 6 | 。在o x L i g l 促进口一1 细胞分化过程中，清道夫受体变化如何?
7、深入探讨泡沫细胞形成中清道夫受体表达变化及机制，可以为进一步认识动脉粥样硬化形成机制提供可靠的实验依据。内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)C = = ：C ：= = = 3 亡：= = ：3 亡= = = a C ：= o图l 单核细胞迁入内膜及泡沫细胞形成模式图F i glT h ep i c t u r e “m o n o c y t em o V eme n d o m e t r i u m 孤df b 锄c e l l sf o 咖a t i o nM C ：单核细胞E C ：内皮细胞s E S ：内皮下间隙S M C ：平滑肌细胞M C P l ：单核细胞趋化
8、蛋白本实验模拟体内环境，采用T H P 一1 细胞替代人外周血单核细胞，以o X L i g 一1 刺激体外培养的n 口一1 细胞，观察o x L 遮一1 对人单核细胞株n 口一1 细胞的趋化作用，旨 在探讨o X L 【) L 中萃取出的脂质体_ o x L 逸一1 在人单核细胞株四一1 细胞分化过程中M C P 一1 及清道夫受体的变化，有助于进一步认识动脉粥样硬化及血栓形成的发病机制，为临床研究和治疗提供新的思路和途径o1 实验材料1 1 主要仪器设备名称倒置显微镜一8 0 低温冰箱电热恒温水浴箱电子分析天平C Q 培养箱S 系列洁净工作台2 0 2 2 A 型数显电热恒温干燥箱压力蒸汽
9、消毒器厂家与产地 O I 啪U S 日本 脚一3 8 2 E 型S a n y o 日本D K 一6 0 0 S 型上海精宏实验设备有限公司B P 一2 1 0 SS a r t o r i u S8 0 7 0 4 9 7 3S a n y o 日本C A 一1 4 8 0 一2 上海汇龙仪表电子有限责任公司上海沪南科学仪器联营厂M L S 一3 7 5 0 型S a J l y o 日本内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2 0 0 8 年)表1I 汀一P C R 引物序列及产物大小T a b1S e d u e n g ea n dp d u c tl e n 豇h vo fR T P C
10、 R1 4 主要试剂的配制( 1 ) 清洁液：将6 0 0 9 重铬酸溶人4 8 0 0 r n l 水中，缓缓加入1 2 0 0 m l 浓硫酸。( 2 ) 青霉素与链霉素：青霉素1 0 0 万u ，链霉素1 9 溶于1 0 0 r n l 三蒸水；分装，每瓶1 m l 。( 3 ) R P M I 1 6 4 0 培养液：取一袋耐，M I 一1 6 4 0 培养基干粉溶于三蒸水中，加入1 0 9碳酸氢钠，1 1 0 m g 丙酮酸钠，2 3 8 9 胍P I 强加入3 5 mp 一巯基乙醇，5 6 碳酸氢钠调P H 值至7 2 7 4 0 补水至1 0 0 0 m l ，抽滤灭菌器过滤除菌
11、，分装，4 密封保存o ( 4 ) 1 0 胎牛血清删I 一1 6 4 0 培养液：已灭活的无菌胎牛血清以1 0 浓度加入已过滤除菌的R P M I 一1 6 4 0 培养液中，另加l 青霉素与链霉素混合液，混匀4 保存。( 5 ) H a J l l 【S 液：N a d8 0 9N a 2 m 0 41 2 H 2 00 1 5 2 9K C LO 4 9K H 2 P 0 40 0 6 9葡萄糖1 O g加蒸馏水至1 0 0 0 r n l ，用3 5 N a H C 0 3 调P H 值至7 3 ，1 0 5 灭菌2 0 r n i n ，4 保存。内蒙古医学院硕士研究生学位论文( 2
12、 0 0 8 年)( 6 ) 0 2 5 胰酶：1 ：2 5 0 胰蛋白酶O 2 5 9H a n k s 液1 0 0 r n l先用少许H a n k s 液溶解胰蛋白酶，去离子水补足至l O O r n l ，置于3 7 水浴中溶解1 h( 时间的长短取决于溶解的程度，待溶液完全透彻清凉为止) o 过滤除菌，无菌分装，一2 0 保存。( 7 ) 0 2 台盼兰：0 1 9 台盼兰溶于5 0 “H a n k S 液中，0 2 2 哪无菌滤器过滤除菌。( 8 ) 4 5 N a C L 溶液：称N a C L2 2 5 9 ，溶于5 0 m I 三蒸水中，搅拌溶解，0 2 2 u m 滤器
13、过滤除菌。( 9 ) 细胞计数液：取4 r n l0 2 台盼兰，1 m l4 5 N a C L 溶液，装入无菌容器中混匀备用o( 1 0 ) P B S 配制( P H 7 2 7 4 ) ：N a C L9 9 N 龇P 0 30 4 9 N a 2 啪36 9加蒸馏水定容至1 0 0 0 m l( 1 1 ) 3 M 醋酸钠：取2 4 6 9 醋酸钠加入约9 0 m l 的去离子水搅拌溶解，冰醋酸调节P H值至5 2 ，去离子水将溶液定溶至1 0 0 r n l ，1 2 0 灭菌2 0 m i n ，4 保存。( 1 2 ) 5 0 n 咂电泳缓冲液：取T r i S4 8 4 9
14、，N a 2E 叽A2 H 2 07 4 4 9 ，约1 8 0 r 1 1 l 的去离子水充分搅拌溶解，1 1 4 2 r n l 的醋酸调P H 值至8 5 ，去离子水定溶至2 0 0 r n l ，高温高压灭菌，4 保存。( 1 3 ) 0 0 1 M1 1 珞洗涤液：1 0 0 0 m lH 2 0 中加入H s1 2 9 ，N A C 璐5 9 ；浓盐酸7 0 0 u I 调P H 值至7 4 02 实验方法2 1n 口一l 细胞培养n 口一1 细胞用含有2 m M 谷氨酰胺、0 0 5 m Mp 一巯基乙醇、1 0 小牛血清砒M I 一1 6 4 0 培养液，3 7 、5 C Q
15、培养箱中培养，维持细胞密度2 1 0 5 r n l ，培养液中加陋P E S1 0 m m 0 1 L 和青霉素、链霉素各1 0 1 0 5 U L ，当细胞生长至指数生长期，可进行传代培养。2 2 细胞分组用乙醇溶解o x L i g 一1 ，终浓度为2 0 m m l ，0 2 2 唧滤膜过滤除菌，4 保存，乙醇溶 解删8 | ，终浓度为1 0 0 u m l ，o 2 2 u m 滤膜过滤除菌，一2 0 保存。实验分组：o X L i g l ( o u m l 、5 u g r r d 、1 0 u g “、2 0 u 彰m l 、4 0 u 彰m 1 ) 分别刺激细胞不同时间( 1
16、 2 h 、2 4 h 、4 8 h ) ，同直鐾直壁堂隧塑巫塞生堂焦鲨塞l 型璺堡2计数资料均数的比较采用x 2 检验。所有统计由统计软件S P I S S1 3 O 完成。3 实验结果3 1 口一1 细胞分化为巨噬细胞光镜下表现镜下正常组耵廿一1 细胞呈圆形，悬浮状态生长；砒i g 一1 作用T H P 一1 细胞1 2 h ，可见少数细胞由悬浮状态变为贴壁状态，贴壁细胞体积增大，细胞形状不规则；矾压A 作 用口一1 细胞1 2 h ，可见贴壁细胞多于幽一1 组，贴壁细胞体积增大，形状由圆形变为梭形、椭圆形或不规则性，可见成熟巨噬细胞的形态。阴性对照( 2 0 0 )4 0u g m l o x L i g - l 作用4 8 h ( 2 0 0 )正常组T l 心1 细胞悬浮生长；4 0l I g m lo x L i g 1
