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1、 军医天蕃硕士学位论文地西他滨与硼替佐米联合治疗急性T 淋巴细 胞白血病的机制研究Am e ch a n is ms t u d yo fm e d icin a ld e cit a b in ea n db o r t e z o m ibint h et r e a t m e n to fa cu t eTly m p h o b la s t icle u k e m ia硕士研究生：刘进指导老师：杨建民教授学科与专业：内科学( 血液病)培养单位：第二军医大学长海医院血液科二。一五年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的
2、地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：纠盟一签字日期： 、j 年歹月少 日学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留p 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：别址导师签名：签字日期：弘l歹年歹月 1 日签
3、- 7 - E t 期：。) 岖年 月孔E t目录中文摘要 l英文摘要 3中英文缩略词汇表 5前言 6月I J 舌 6第一部分 1 0材料与方法 1 1结果 1 8讨论 2 3参考文献 2 4第二部分 2 8材料与方法 2 9结果 3 3讨论 3 9参考文献 4 0第三部分 4 3材料与方法 4 3结果 5 3讨 仑 5 8参考文献 5 9结论 6 1综述 6 2在读期间发表论文 6 9致谢 7 0地西他滨与硼替佐米联合治疗急性T 淋巴细胞白血病的机制研究摘要目的：白血病是血液系统的一种恶性疾病，病情险恶，严重威胁人类的健康。白血病细胞由于自我更新能力增强，增殖失控，分化障碍，凋亡受阻，侵袭并
4、破坏人类各脏器系统。随着科学技术的进步，目前对白血病的认识已更加深入、系统和全面，但仍存在许多亟待解决的问题，如：白血病起病的原因、发病机制、如何预防及彻底根治等。化疗和造血干细胞移植仍是目前白血病治疗的主要方法，随着多项新技术的开展，白血病的疗效得到了提升。如生物靶向治疗：抗C D 2 0 、C D 3 3 、C D 5 2 的单克隆抗体，针对B C R A B L 、P M L R A R ( I 融合基因靶向药物的应用，凋亡调节因子的靶向治疗( 针对b cl2 ) 等，使白血病患者明显受益。尽管如此，但成人急性T 淋巴细胞白血病( T - A L L ) 的治疗目前仍缺乏有效的治疗手段，
5、且预后差。我们实验室前期工作已证实硼替佐米可抑制急性T 淋巴细胞白血病的肿瘤性增生，但移植后的致瘤小鼠最终仍死于白血病，考虑存在其它的致瘤机制，值得进一步探讨。寻找治疗急性T 淋巴细胞白血病的新的作用靶点，具有重大意义。方法：C C K 一8 法检测去甲基化药物地西他滨或联合硼替佐米对N o t ch l高表达的急性T 淋巴细胞白血病细胞株M O L T - 4 的增殖的影响；A n n e x in V P I 双染法检测细胞凋亡；P I 染色检测细胞周期；二代测序转录组高通量测序法筛选用药前后两组问差异基因；R T - P C R 法检测P a x 5 、N F 1 ( B ( p 6 5
6、 ) 及N o t ch l下游靶基因H e s lm R N A 的表达情况；构建携带P a x 5 过表达基因载体的慢病毒；侵染M O L T - 4 细胞；C C K 8 法检测细胞增殖情况；R T - P C R 法检测目的基因P a x 5m R N A 的表达，蛋白免疫印迹法( W e s t e r nb lo t ) 检测N o t ch l通路下游蛋白如H e s l及凋亡蛋白如C a s p a s e 3 和C a s p a s e 9的表达量。结果：不同浓度的地西他滨作用于M O L T - 4 细胞4 天，随着时间延长和剂量的加大，地西他滨对M O L T - 4
7、细胞株的增殖抑制作用越明显。A n n e x in V 伊I 双染法检测细胞凋亡增多，P I 染色检测检测G 0 G 1 期细胞比例增多，细胞被阻滞在G 0 G 1 期。且地西他滨与硼替佐米两药共同作用M O L T - 4 细胞比单用一种药物的抑制效果更明显。地西他滨对M O L T - 4 细胞增殖的作用结果显示0 5 9 m o lL 地西他滨作用7 2 小时后，M O L T - 4 细胞的增殖活力为对照组的3 0 2 4 - 2 2 ( P 6 0 岁者鲜见，白细胞数常增高，易伴发纵膈肿块。寻找针对急性T 淋巴细胞白血病更有效的治疗手段，将具有重大意义。虽然近年来各种新型治疗方法出
8、现及开展使用，如：诱导分化治疗、靶向治疗、生物化学治疗等。但T - A L L的治疗效果仍无明显改善。一种可能的新药的探索及研究，或将成为疾病治疗的新手段。在肿瘤研究中，异常的D N A 甲基化是目前公认的在癌症中最常见的分子异常，经常与药物抗性相关联心1 。D N A 异常甲基化在癌症发生中有显著作用，它使得抑癌基因的沉默，癌基因激活及促进癌症转移皿1 。在健康人群中，抑癌基因的启动子区C p O 岛( C G 二核苷酸在D N A 上集中的小区域，通常位于启动子及第一外显子区，长约2 k b )通常呈现低甲基化状态，当发生甲基化时，转录受到抑制，抑癌基因沉默，致使正常细胞转变为肿瘤细胞，严
9、重威胁人类的健康。研究已发现许多抑癌基因的甲基化异常改变导致肿瘤的发生，如肿瘤抑制基因P 1 6 1 ，R b lH l，B R C Al 5 ，A P C 畸1 和p 5 7 口1 等，它们的基因改变分别涉及包括白血病、肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌等几乎所有类型肿瘤。尽管甲基化异常与肿瘤关系紧密，但对两者相互作用间的内在机制仍不十分清楚，具体机制的阐明还需进一步研究。既然甲基化异常引起肿瘤的发生，严重威胁人类的生命。那么我们可否通过扭转这种改变，从而达到治疗疾病的目的。相关研究报道，通过D N A 去甲基化作用，使失活的基因重新被激活，确实能改善某些疾病旧9 1 。那么，我们
10、通过探讨去甲基化药物对恶性肿瘤的影响，深入研究其内在机制，或将找到疾病治疗的新方法。N o t ch 途径是一个高度保守的信号传导途径，调节各种细胞过程，包括干细胞的维持，细胞命运的调控，细胞增殖、分化，细胞死亡和成人组织稳态n0 | 。其信号转导涉及不同的组织，包括上皮、神经、血液、骨骼、肌肉和血管n 。确保N o t ch 信号传导的精确性和持续性，对于各个发育索和细胞的正常发育至关重要。一旦N o t ch6 一地西他滨与硼替佐米联合治疗急性T 淋巴细胞白血病的机制研究信号转导的异常，将导致人类疾病和癌症n0 l。N o t ch 信号同样调控造血干细胞的造血功能n 列及各种血细胞的分化
11、n3 J 。T - A L L 的基因研究已经发现功能缺失突变和致癌之间显著相关。在众多基因改变中，N o t ch l激活突变是最频繁发生的遗传缺陷。发生于5 0 以上的T - A L L 的患者n4 | ，说明N o t ch l激活突变在T - A L L 发病中扮演一个重要的角色。其中N o t ch lD 11 4 的相互作用在诱导T 谱系分化中至关重要n5 | 。N o t ch 信号转导可实现T C R - 重排n6 j ，调节T C R - QB 与一Y6 表达n 引，支持B 选择的增殖n 引，然而一旦超出了发育检测点的持续的N o t ch l信号活化将诱导T - A L L
12、 。N o t ch l激活突变被认为是T - A L L 最常见的遗传改变n9 | 。N o t ch l基因激活导致N o t ch l受体的胞内结构域( I C N l) 转录激活，随后作用于多个目标基因的直接调节心0 | 。尽管相关研究很多，然而这些基因的性质，以及它们的依赖性激活机制，仍不是很清楚。在通常情况下，致癌N o t ch 信号通过直接上调多个合成代谢的基因的转录，包括核糖体的生物合成，蛋白质翻译和核苷酸和氨基酸代谢，促进白血病T 细胞的生长。此外，N o t ch l正向调节G 1 S 期的细胞周期进程心和上调一些细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶心钉及基因m y c在T - A L L 发生中发挥重要作用。而且，N o t ch 信号还通过H E S l介导的P T E N 抑制调节细胞的大小，葡萄糖的摄取及P 1 3 K - A K T 激活糖酵解。除了H E S l的直接调节，N o t ch l还参与早期T 细胞基因：如P r e T C RQ ( P T C R A ) 和I L 7 R 的调控心引。总之，不管是在正常T 细胞发育还是T - A L L 的发生发展中，N o t ch l通过调控这些基因和通路，以及更多信号通路发挥作用，N o t ch l信号转导系统是一个复
