流式细胞仪在睡眠性阵发性血红蛋白尿的诊断中的应用

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1、中国试剂网 3.8.8.16 流式细胞仪在睡眠性阵发性血红蛋白尿的诊断中的应用 一.睡眠性阵发性血红蛋白尿 PNH 睡眠性阵发性血红蛋白尿（PNH）是一种获得性造血干细胞异常，临床主要表现为骨髓丧失造血功能、血栓、慢性溶血性贫血急性发作。PNH 的发病率很低，发病原因不详，可能与再生障碍性贫血有关系。PNH 的临床表现不一，疾病进程多变，给临床的诊断治疗和疾病研究带来很多困难。最近 15 年，在 PNH的细胞和分子生物学研究中取得了重要进展，定义了导致 PNH 异常表现的分子缺陷。而使用流式细胞仪进行 PNH 诊断分型，是 PNH 研究的又一里程碑。 （一）历史回顾 Strubing 早在一个

2、世纪之前，就第一次报告了 PNH，症状为溶血性贫血，伴有夜间血红蛋白尿。50 年后，Ham 和 Dingle 证明了 PNH 患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的 Ham 实验，用来诊断 PNH。不久，又发现 PNH 的溶血是由于患者的红细胞对补体敏感。进而又发现 PNH 患者的中性粒细胞和血小板也有异常。Dacie 在 1963 年提出了 PNH 是由于干细胞突变造成的获得性克隆异常的假说。后来，通过对两位患有 PNH 的妇女的异构酶葡萄糖 6 磷酸脱氢酶的研究，证实了这一假说。PNH 红细胞中只含有一种异构酶，而病人正常红细胞中含有两种异构酶。 （二）生化缺陷 1

3、983 年，PNH 红细胞的生化研究表明，PNH 缺乏一种被称为延迟加速因子DAF 的补体调控蛋白。这种蛋白抑制补体 C3 转换酶的形成，并通过glycophosphatidylinositol （GPI） 的锚定作用 （翻译后处理步骤） 固定在细胞膜上。进一步研究表明，PNH 细胞缺少这种通过 GPI 与细胞膜的正常连接。这意味着，GPI 锚定蛋白的合成异常，是 PNH 的起因。PNH 细胞系的 GPI 合成的生化通路也 异 常 ， 这 种 异 常 发 生 在 通 路 的 第 一 阶 段 的 N-acetylglucosamine 到phosphatidylinositol 的转移过程中。

4、（三）分子缺陷 1993 年 Miyata 等发现了 PHN 的基因缺陷。 通过对一系列复杂的补体和转染研究，证实了 PNH 细胞系的 phosphatidylinositol glycan complementation class A（pig-a）基因表达了错误的 GPI 相关的抗原。对 pig-a 基因进行序列分析，发现中国试剂网 3.8.8.221 迄今为止， 所有报导过的 PNH 病人都有 pig-a 基因的突变。 由于这种突变发生在体细胞，所以表现不一致，并且在整个 pig-a 编码区域中，都有发生突变的可能。这些突变包括缺失、插入和点突变。所有的缺失和插入部分都很小（只有一到二个

5、） ，导致漂移突变，产生了无功能产物。漂移突变导致了细胞完全缺乏 GPI 锚蛋白（III 类细胞） 。另一部分突变是点突变，保留部分活性，可以合成少部分的GPI 锚蛋白。这种突变细胞表达部分 GPI 锚蛋白（II 类细胞） 。由于 pig-a 基因位于 X 染色体，每个细胞只有一个功能性 pig-a 基因（女性 X 染色体失活） ，因此，单一突变会造成 GPI 缺失表型。相反，每个细胞中都有两个具有活性的常染色体 pig 基因，只有常染色体上两个等位基因都发生突变，才会产生 PNH 症状。 （四）流式细胞仪分析 使用分子生物学已经成功发现了 PNH 的基因缺陷，而使用单克隆抗体和流式细胞仪技术

6、则是发现诊断 PNH 表型异常的重要手段，具有同样的重要意义。1985 年，两个各自独立的小组使用流式细胞仪和 DAF（CD55）抗体，调查 PNH患者，发现了缺乏 DAF 的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板。这都证明 PNH 的多系特征，有力支持 PHN 是克隆性干细胞疾病的学说。进一步分析 PNH 病人骨髓造血干细胞，发现也缺乏 DAF 的表达。之后，随着新的 GPI锚蛋白单克隆抗体的出现， PNH的研究又进一步深入。 Van der Schoot等发现PNH患者中性粒细胞缺乏 CD16、CD24 和 CD67（后来有更名为 CD66b） 。同时，他们第一次证明在 PNH 诊断中

7、，流式细胞仪检测优于 Ham 实验。在研究中，他们分析了 16 例再生障碍性贫血的病人， 在 3 例病人的粒细胞中发现了少量 PNH 克隆，而这 3 例病人 Ham 实验均阴性。后来有人又进一步证实了一些严重再生障碍性贫血的病人有 GPI 缺乏的粒细胞和单核细胞，而红细胞可以正常。于是，流式细胞仪诊断 PNH 的可靠方法很快建立起来，同时，还用来判断 PNH 的疾病程度和 PNH 克隆的造血细胞系别来源。现在，尽管目前使用的流式细胞仪检测技术在方法学和抗体选择上还没有统一， 但它已经取代了 Ham 实验， 成为了 PNH诊断的“金标准” 。使用流式细胞仪可以发现 Ham 实验阴性的再生障碍性贫

8、血病人中存在的少量 PNH 细胞，这可以将 PNH 分为两种情况： （1）溶血性 PNH，特征是显性溶血性贫血，同时有血红蛋白尿。值得注意的是，这组病人中，有50%发生静脉血栓，这是导致病人死亡的主要原因。 （2）再生不良性 PNH，可以中国试剂网 3.8.8.221 检出 GPI 缺乏的造血细胞，没有显性溶血，但可能有其它症状，如再生障碍性贫血、 白细胞减少症或血小板减少症。 这组病人中， 有 10%死于再生障碍性贫血。 很多病人由于同时具有以上两组的症状，而不能单纯分类归于某一组。有一部分病人有再生不良性 PNH，然后进展为溶血性 PNH。另一小部分病人但在临床上很重要首先就有血栓形成，临

9、床上却没有溶血症状。而且，发现及少数病人有先天性（非 pig-a 突变）GPI 缺乏。一些研究小组也报导了 Budd-Chiari综合症（肝静脉栓塞）病人伴有 PNH 高发。很明显，遇到病人血栓形成（如肝静脉和脑静脉）无法解释时，应该排除 PNH 的可能。 二.PNH 的实验室诊断 基于红细胞补体敏感性的实验在有流式细胞术之前，PNH 检查主要依靠溶血实验。Ham 实验、蔗糖溶血实验和改进的 Ham 实验的原理是：PNH 红细胞对溶血的敏感性与正常细胞不同。这些实验虽然对溶血性 PNH 有效，但既不能有效检测出 PNH 红细胞含量少的样本，也不能区分部分缺失和完全缺失的细胞。另外，由于输血原因

10、，且 PNH 红细胞的寿命较短，以上这些实验都不能对 PNH克隆给予准确判断。研究表明，通过流式细胞仪分析发现 GPI 缺乏的中性粒细胞，可以更加准确地判断 PNH 克隆的情况。Ross 及其同事于 1906 年代创建了补体溶血敏感实验（CLS） ，这个实验可以对 PNH 红细胞的类型和比例给予更准确的判断。但是，CLS 实验及费时费力，难于操作，不适合常规诊断。近来又改进方法， 发展了 DiaMed 单克隆抗体胶技术， 用于 PNH 筛查， 它克服了一些 CLS方法的技术难点。这一方法可以在血液病实验室常规使用，但是与流式细胞仪方法比较，其灵敏度、特异性都要差一些。而且 DiaMed 方法仍

11、然需要做大量的临床实验，来验证方法的可靠性。 （一）流式细胞仪 使用流式细胞仪分析血细胞 GPI 锚蛋白，需要考虑设门的策略和抗体的选择。而且，对于 PNH 检测的结果的解释，有赖于对 GPI 相关抗原在细胞上的分布和在造血细胞分化的不同阶段有不同表达（见下表）的相关知识的了解。用流式细胞仪检测 PNH，并不是说在 PNH 细胞上，所有的诊断用抗原全都不表达。因此，应该所有细胞类型上筛查至少两种 GPI 抗原，以排除先天性单一抗原缺乏的可能，同时排除技术原因造成的误差。另外，应该使用跨膜抗原检测做为阳中国试剂网 3.8.8.221 性对照。 1.红细胞分析：早期的研究检测集中在红细胞 GPI

12、相关抗原的表达上。原因有二。 第一， 疾病主要的临床症状是溶血。 第二， 以往的 PNH 筛查实验， 如 Ham实验和蔗糖溶血实验，是红细胞检查。PNH 以前属于于获得性溶血性贫血，但是现在发现是属于干细胞异常。尽管目前还没有一致的设门策略，我们倾向于前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC）使用对数放大模式，并根据红细胞的物理特性，FSC/SSC 设门。同时，检测一个已知在所有红细胞上都表达的非GPI 相关的糖蛋白抗原，计算阳性百分率，用来判断 FSC/SSC 设门的纯度。与分析淋巴细胞、白细胞或干细胞的 Boolean 设门策略相比，这种设门方法不够理想。在做红细胞多色分析时，应该考虑

13、红细胞聚集造成的影响。细胞洗液和单抗试剂中有少量蛋白成分，容易使结合了抗体的红细胞发生聚集。因此，我们选择做单色分析。 在 PNH 红细胞常规筛查实验中，建议使用直标抗体，检测两种 GPI 相关抗原CD55 和 CD59。如果检测到阴性或部分缺失的细胞，一定是两种 GPI 相关抗原同时缺失，才可以诊断 PNH。这是因为，有一些少见的遗传性缺失的病人可以缺少 CD55 或 CD59 之一。 分析未输血的 PNH 病人，发现细胞可以明显分为三种类型：III 型细胞（完全缺失） 、II 型细胞（部分缺失）和 I 型细胞（正常表达） 。不同病人的三型细胞的Mark 设定可能会有所不同，有时三群细胞可能

14、不能清楚地分开。 大多数 PNH 病人的粒细胞异常克隆比例大于红细胞异常克隆。这是由于与正常红细胞相比，PNH 红细胞的寿命较短，且输血后，比例减少。近年来的研究表明，III 型红细胞的寿命为 17-60 天，II 型红细胞（CD59 至少为正常细胞表达量的 15%） 可以较少产生补体介导的溶血反应。 有趣的是， 使用噻唑橙和 CD59分析 PNH 患者的网织红细胞， 发现 PNH 网织红细胞的比例与中性粒细胞克隆的比例相近。这说明，在 PNH 中，红细胞和中性粒细胞的骨髓前体具有相似的增殖能力，检测 PNH 患者的网织红细胞可以提供有关红细胞生成率的重要信息。很显然，未来的流式细胞仪检测趋势

15、是利用物理信号和荧光信号，建立一个更加有效的红细胞设门策略。 2.粒细胞分析：以前对 PNH 粒细胞的研究主要是 FSC/SSC 设门的单色或双中国试剂网 3.8.8.221 色研究。尽管用此方法做单抗原分析是可行的，但是只利用粒细胞的物理特征进行设门可能会导致某些误差。在许多 PNH 病历中，普遍认为位于粒细胞门中的中性粒细胞占绝大多数。但是，有时也会存在有相当数量的嗜碱性粒细胞。在使用 CD16 单色分析含量较少的粒细胞 PNH 克隆时，误差就暴露了，因为中性粒细胞 CD16+，但正常嗜碱性粒细胞 CD16-。FSC/SSC 设门的另一个问题是，骨髓增生异常综合症时，会有许多无颗粒中性粒细胞，这时，只使用物理特征就无法设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC 设门。 最好使用三色分析检测 PNH 粒细胞。检测时，应该保证在操作过程中减少细胞丢失，同时使用 SSC/非 GPI 相关蛋白的