《一株具有高除草活性的真菌菌株》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株具有高除草活性的真菌菌株（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Mycosystema 菌 物 学 报 15 September 2008, 27(5): 645-651 ISSN1672-6472 CN11-5180Q 2008 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved. 一株具有高除草活性的真菌菌株 张剑1 董晔欣2 张金林1 董金皋1*1河北农业大学植物保护学院真菌毒素实验室 保定 071001 2保定市第二中学 保定 071000 摘 要：以从湖南张家界国家森林公园的发病毛竹上分离的一株病原真菌为研究材料，经生物测定发现该菌产生的粗毒素具有很强的除草活性，具有开发为生物除草剂的潜力。根
2、据形态学特征和 rDNA ITS 测序分析，该菌为小孢拟盘多毛孢 Pestalotiopsis microspora。 关键词：毛竹，小孢拟盘多毛孢，ITS，菌种鉴定 A fungal strain having high herbicidal activity ZHANG Jian1 DONG Ye-Xin2 ZHANG Jin-Lin1 DONG Jin-Gao1*1Laboratory of Mycotoxicology, College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Chin
3、a 2No.2 Middle School of Baoding, Baoding 071000, China Abstract: A phytopathogenic fungus with high herbicidal bioactivity isolated from Zhangjiajie National Forest Park of Hunan Province might be developed as herbicide. The fungus was identified as Pestalotiopsis microspora according to its morpho
4、logy and alignment analysis of rDNA ITS. Key words: Phyllostachys pubescens, Pestalotiopsis microspora, ITS, identification 化学除草剂具有作用迅速、使用方便等特点，在杂草治理中发挥了重要作用，特别是超高效除草剂磺酰脲类化合物的发现，将除草剂的开发和应用推向一个新阶段。然而，化学除草剂的大量使用也逐渐暴露出诸多弊端，如作物药害、耐药杂草种群上升、环境污染日趋严重等等。 基金项目：国家“863”计划（No. 2006AA10A214） ；河北省科技重大攻关项目（No. 032
5、20142D） *Corresponding author. E-mail: ; Tel: 0312-7528266 收稿日期：2007-12-12，接受日期：2008-04-15 646 Mycosystema 进入 21 世纪后，随着人们环境保护意识的增强和农业可持续发展的需要，人们对生物除草剂日益关注。由于生物除草剂具有对目标杂草以外的植物影响小、环境负效应小、安全性高等特点，近年来国内外许多研究机构将目光和研究的重点向生物除草剂尤其是微生物除草剂的研制方面转移（李扬汉等 1994；强胜 1997；Boyetchko 1997） 。微生物除草剂尤其是真菌除草剂的开发和研究获得了突破性进展
6、，已有约 80 种不同的致病生物得到了研究，可防除约 70 种杂草。具有除草活性可望开发成除草剂的真菌主要集中在刺盘孢属 Colletotrichum、镰孢属 Fusarium、链格孢属 Alternaria、葡萄孢属 Botrytis、尾孢属Cercospora、柄锈菌属 Puccinia、叶黑粉菌属 Entyloma、壳二胞属 Ascochyta 和核盘菌属Sclerotinia 等 9 个属以及卵菌的疫霉属 Phytophthora（马娟和董金皋 2006） 。 迄今为止，已商品化的最成功用于茎叶处理的真菌除草剂是Collego，它是由引起杂草炭疽病的盘长孢状刺盘孢田皂角专化型Colle
7、totrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. et Sacc.f. sp. aeschynomene 产生的孢子制成干孢子可湿性粉剂，对水稻和大豆田中的弗吉尼亚皂角Aeschynomene virginica的防效达 90%以上（顾成波和赵长山 2003） 。在美国登记注册的Devine是棕榈疫霉Phytophthora palmivora (E.J. Butler) E.J. Butler致病菌株的厚垣孢子制成的悬浮剂。此外，Casst是决明链格孢Alternaria cassiae Jurair et A. Khan分生孢子制成的可湿性粉剂，以及在加拿大研
8、制成功的Biomal是盘长孢状剌盘孢锦葵专化型C. gloeosporoides f. sp. malvae的孢子制成的悬浮剂等等，还有许多生物除草剂已被商品化，可见生物除草剂的开发与应用已经成为社会发展的大趋势。 本实验室利用 HPLC、GC-MS、NMR、EI、IR 等现代仪器分析和结构鉴定手段，已从灰葡萄孢 Botrytis cinerea Pers.、瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp.等菌的代谢产物中分离和鉴定出脱落酸、脱落酸葡萄糖苷、脱落酸葡萄糖酯、10-顺-二氢化灰霉二醛、邻苯二甲酸二甲酯等具有较强除草活性的化合物。最近从发病毛竹叶
9、片上分离纯化得到一株真菌，通过有机溶剂萃取该菌的培养滤液得到其粗毒素，经生物测定发现粗毒素具有很高的除草活性，具有开发成生物除草剂的潜力。因此，本文对该菌的形态学、生理学、核糖体 ITS 序列以及除草活性进行了深入研究和分析。 1 材料和方法 1.1 菌株、植物与培养基 供试菌株分离自湖南张家界国家森林公园的发病毛竹 Phyllostachys pubescens Mazel ex H. de Lehaie；供试杂草为马唐 Digitaria sanguinalis (Linn.) Scop.、反枝苋 Amaranthus retroflexus Linn.、狗尾草 Setaria virid
10、is (Linn.) Beauv.、虎尾草 Chloris virgata Swartz、播娘蒿 Descurainia sophia (Linn.) Schur.、黄顶菊 Flaveria bidentis (Linn.) Kuntze、苘麻 Abutilon theophrasti Medic.、稗草 Echinochloa crusgalli (Linn.) Beauv.。PDA 培养基用于菌种保存和菌饼的制备，PD 液体培养基用于毒素产生。 1.2 菌株的形态学特征观察 对分离获得的真菌进行单孢纯化和培养。在光学显微镜下观察菌株的菌丝及分生孢子Vol.27 No.5 647 的形态特征
11、， 并测量分生孢子的大小。 将成熟的分生孢子置于 D-果糖水溶液中 （50mmol/L）于 25培养 8-10h，观察分生孢子的萌发情况。将直径为 6mm 的菌苔接种于 PDA 平皿（=90mm）中，于不同温度、pH 值下培养，测定菌落生长速度，观察菌落扩展和菌落形态。 1.3 菌株的致病性分析 采用柯赫氏法则对菌株进行致病性测定。在 PDA 培养基上 25培养，待产生孢子后，分别利用菌丝和孢子悬浮液针刺回接到健康的毛竹叶片，在自然条件下观察其发病情况。自人工接种的病斑上再按常规方法分离病原菌，并与接种用菌株进行形态学比较。 1.4 菌株粗毒素的制备 打取菌苔接种到 PD 液体培养基中，于室温
12、静止培养 10d，然后过滤，得到培养物滤液。滤液用等体积乙酸乙酯萃取 3 次，合并有机相，42下减压旋转蒸发，得粗毒素，再用甲醇定容，于-20保存备用。 1.5 菌株粗毒素的除草活性测定与除草谱试验 采用茎叶处理法，先将粗毒素置于表面皿内，自然晾干，再用 1601:水=1:150 的混合溶液 1mL 溶解。将马唐、稗草、狗尾草、虎尾草、反枝苋、播娘蒿、苘麻、黄顶菊等待测杂草种植在口径 6cm、高 12cm 的塑料杯中。将杯子放入搪瓷托盘中，托盘中加入适量的水，然后置于室外（25-30）自然生长，待杂草长到 3 叶期时，将毒素均匀涂布于待测杂草上，设空白对照，每个处理 3 个重复，72h 后观察
13、效果。 1.6 菌株基因组 DNA 的提取和 PCR 扩增 将供试菌株在 PDA 上培养 4-5d，再打成菌苔转接到PD液体培养基中培养 7d，过滤收集菌丝体，用滤纸压干后置于-80冰箱中保存备用。基因组DNA提取采用 CTAB 法，即取 0.1g菌丝体用液氮研磨呈细粉状， 转入 1.5mL 离心管中， 加入 700L 2% （w/v） CTAB（Cetyltrimethylammonium bromide）缓冲液，于 65水浴 30min至 2h，按 Zolan B: Conidia. 2.2 菌株的致病性 将菌株回接到毛竹叶上，10d 后观察到该菌已经导致毛竹叶片发病。病斑梭形，灰白色，
14、沿叶脉延伸， 其发病症状和初分离时寄主发病症状相同。 剪取发病竹叶的病健交界处，进行病菌的再分离，又得到了该菌，表明该菌株是毛竹上的致病真菌。 2.3 菌株的生物测定和除草谱 Vol.27 No.5 649 用该菌株的粗毒素进行除草活性检测，发现粗毒素对供试杂草均有较高的致死活性，其中对马唐的致死率可达 95%以上，对反枝苋可达 90%以上（图 2） ，对狗尾草、虎尾草、播娘蒿、黄顶菊的致死率也均在 80%以上，对苘麻和稗草的作用稍弱，但致死率也在 60%以上（表 1） 。 图 2 粗毒素对反枝苋和马唐的杀除效果 A：反枝苋（CK） ；B：反枝苋（毒素处理） ；C：马唐（CK） ；D：马唐（毒
15、素处理）. Fig. 2 Herbicidal effect of Pestalotiopsis microspora toxins to Amaranthus retroflexus and Digitaria sanguinalis. A: A. retroflexus (CK); B: A. retroflexus (toxin test); C: D. sanguinalis (CK); D: D. sanguinalis (toxin test). 表 1 小孢拟盘多毛孢粗毒素对杂草的抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of Pestalotiopsis microspora toxins on weeds 杂草 Weed CK 萎蔫率（%） Plant wilt percentage（%） 处理萎蔫率（%） Treated plant wilt percentage（%） 马唐 Digitaria sanguinalis - + 反枝苋 Amaranthus retroflexus - + 狗尾草 Setaria viridis - + 虎尾草
