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1、黄瓜棒孢叶斑病病原菌 RFP 标记转化株的 构建谢学文 张自心 武 军 石延霞 柴阿丽 李宝聚*（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要：由多主棒孢（Corynespora cassiicola）侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病已成为我国黄瓜生产上的重要新流行病害，目前尚缺乏抗性品种，病原菌侵染机制及与寄主的互作关系尚不清楚。为了开展多主棒孢的病原学研究，本试验采用农杆菌基因介导技术（ATMT） ，获得了红色荧光蛋白（RFP）标记的多主棒孢转化株，转化株在 PDA 培养基转接 6 次后仍能在菌丝和分生孢子上发出强烈的红色荧光，生物学测定和致病性测定结果表明该转化株与野生型菌株无显著差
2、异。关键词：黄瓜棒孢叶斑病；多主棒孢；农杆菌介导法；RFP染逾 530 种植物。国内外有关该病菌的研究主要集中在生物学特性、遗传稳定性和抗药性等方面（Dixonetal.， 2009； Miyamotoetal.， 2010； 高苇等，2012；李宝聚等，2012；D onetal.，2014） ，对多主棒孢致病机理及侵染途径方面研究较少。红色荧光蛋白（redfluorescentprotein，RFP）最早从印度洋 - 太平洋地区的珊瑚虫中分离而得，在不同温度和 pH 条件下具有较高的稳定性，且与其他蛋白形成的融合蛋白通常仍具有荧光，因其具有易于检测、荧光稳定、无毒害、种属通用、易于构建载体
3、、可进行活细胞定位定时观察等特性而得到广泛关注（Lorangetal.，2001） 。RFP 随机插入真菌基因组中，可直观、快速、简便地动态观察谢学文，助理研究员，专业方向：植物病理学，E-mail： * 通讯作者（Correspondingauthor） ：李宝聚，研究员，博士生导师，专业方向：蔬菜病害综合防治，E-mail：收稿日期：2017-10-24；接受日期：2017-12-06基金项目：国家自然科学基金项目（31401888） ，国家大宗蔬菜产业技术体系项目（CARS-25）黄瓜（Cucumis sativus L.）是我国重要的蔬菜作物之一，种植面积居世界首位，且逐年增加。近几年
4、，由多主棒孢（Corynespora cassiicola）侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病成为危害我国黄瓜生产的重要新流行病害（李宝聚等，2008；韩小爽等，2011；杨双娟等，2012） ，危害范围和程度甚至超过霜霉病和白粉病。该菌寄主范围广泛，能够侵Abstract：Twenty-fourChinesecabbage（Brassica rapa L.ssp.chinensis）materialswereinoculatedwith3kindsofPlasmodiophora brassicaeM01，M02andM03，andallthelineswereidentifiedbymolecula
5、rmarkersinordertoobtainexcellentanti-sourcesandtoconfirmallmaterialscontainingdiseaseresistantgenes.Theresultsshowedthattherewere10outof24materialswereresistanttodisease.Amongthem5wereresistantto3kindsofPlasmodiophora. LinesCR004andCR007containedthediseaseresistantgeneCRk，CR013containingdiseaseresis
6、tantgenes CRa，CRbkato，CRkandCrr3.CR015andCR016containedthediseaseresistantgenesCRa，CRbkatoandCrr3.All3materialsshowedresistancetoM01andM02.LineCR012containeddiseaseresistantgenesCRaandCRbkato.CR014andCR018containeddiseaseresistantgenesCRa，CRbkatoandCRk.TheCR021linecontaineddiseaseresistantgenesCrr2a
7、ndCRk. TheCR023linecontaineddiseaseresistantgenes CRcandCRkshowedresistancetoM02.Key words：Brassica rapa；Clubroot；Anti-sourcescreening；Molecularmarker4545研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2018（3） ：45-49中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g真菌定殖及其与寄主的互作机制（deSilvaetal.，2009） ，可用于检测真菌在寄主中的生长速率、研究真菌与寄主侵染互作模式等（Corm
8、ack，1998） 。目前多主棒孢对黄瓜的致病机理研究还不深入，利用多主棒孢 RFP 标记转化株有利于直接观察病菌侵染过程，在抗病基因挖掘、致病机理分析等方面具有重要的意义。农杆菌基因介导技术（ATMT）一直用于植物基因的转导（Tinland，1996） ，直到 1995 年，Bundock 等（1995）报道 ATMT 技术不仅能将农杆菌的 T-DNA 转移到植物基因组中，也可转移到酿酒酵母基因组中，自此，ATMT 技术开始应用于真菌研究（Michielseetal.，2005） 。与其他遗传转化方法相比，该技术最方便的优势是能以孢子、菌丝或子实体等为介导材料，操作方便且成功转化率高（Min
9、z&Sharon，2010） 。基于此，本试验拟利用农杆菌介导法构建黄瓜棒孢叶斑病病原菌 RFP 标记转化体系，获得多主棒孢 RFP 标记菌株，为多主棒孢侵染黄瓜的机制研究奠定基础。1 材料与方法试验于 2015 年 19 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。1.1 试验材料黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢Corynspora cassiicola（Berk&Curt）Wei. HG09031510（单孢菌株） ，质粒农杆菌 AGL-GNEN（携带 RFP 基因和潮霉素 B 抗性基因的质粒 pch-RFP） ，均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。乙 酰 丁 香 酮 水 剂，98%MES， 葡
10、萄 糖， 甘油，HCl，KH2PO4，K2HPO4，NH4NO3，CaCl2，MgSO47H2O，NaCl，头孢噻唑钠，潮霉素 B，卡那霉素， 利福平， 均购自于北京酷来搏科技有限公司。真菌基因组 DNA 提取试剂盒，ddH2O，DNA聚合酶， dNTP， MgCl2， 16SrDNA 通用引物， 琼脂糖，TAE 缓冲液，Goldview 核酸染料，LoadingBuffer，DNAmarkerDL5000，均购自于天根生化科技（北京）有限公司。PDA 培养基（每升） ：去皮马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 18g；PD 培养基不加琼脂。LB 培养基（每升） ：胰蛋白胨 10g，酵母提取
11、物 5g， 氯化钠 10g； 固体 LB 培养基另加琼脂 18g。最后用蒸馏水定容至 1000mL，并用 NaOH 将 pH调至 7.2。YEB 培养基（每升） ：酵母提取物 1g，牛肉提取物 5g，蛋白胨 5g，蔗糖 5g，MgSO47H2O4g。MM 培养基（每升） ：葡萄糖 2g，K2HPO42.05g，MgSO4 7H2O0.6g，CaCl20.01g，NH4NO30.5g，KH2PO41.45g，NaCl0.3g，pH 调至 6.77.0。IM 培养基（每升） ：MM 培养基，甘油 5g，98%MES8.7g，乙酰丁香酮水剂 200molL-1，pH 调至 5.4（98%MES 和乙
12、酰丁香酮水剂均于灭菌完成后再加入） 。1.2 供试菌株对抗生素的敏感性测定配制含不同浓度潮霉素 B（0、10、20、50、80、100gmL-1）的 PDA 平板，挑取活化后的黄瓜棒孢叶斑病菌菌饼（直径 5mm）接种至平板中央，26黑暗培养 5d。观察菌落生长状况，测量菌落直径。配制含不同浓度（0、10、20、50、80、100gmL-1）头孢噻唑钠和卡那霉素混合使用的 LB 平板， 取 100L 农杆菌菌液（OD600=0.3）均匀涂布于平板上，28倒置培养 2d，观察菌落生长状况。每个处理 3 次重复。1.3 真菌转化与筛选ATMT 转化体系在 Bundock 等（1995）报道的方法上进
13、行优化。挑取活化的农杆菌 AGL-GENE（含质粒 pch-RFP）单菌落接种于含 50gmL-1卡那霉素的 MM 培养基，28、22rmin-1振荡培养 48h。培养物 4000rmin-1离心 1min，用 IM培养基稀释， 重复 1 次， 用 IM 培养基继续培养 46h。将诱导培养的农杆菌（100L）与制备好的黄瓜棒孢叶斑病菌孢子悬浮液（100L）混匀后，涂布于放置在YEB固体培养基的硝酸纤维素膜上。共培养后，将硝酸纤维素膜剪成条状，反铺在含潮霉素 B、头孢噻唑钠和卡那霉素的 PDA 平板（选择性培养基）上。26黑暗培养 3d，挑选转化株至选择性培养基上，进行再次筛选并保存。1.4 R
14、FP 标记菌株的 PCR 检测利用 RFP 特异性引物对转化株基因组进行PCR 检测。将转化株接种至 PD 培养基中，28、120rmin-1振荡培养 7d，收集菌丝，并进行冻干处理。按照真菌基因组提取试剂盒的方法进行 DNA4646研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g的提取。参考阮玲云等（2015）的方法，利用 RFP特异性引物：RFP-F5 -CGGGATCCATGGTGCGCTCCTCCAAGAA-3 ， RFP-R5 -GGACTAGTCTACAGGAACAGGTGGTGGC-3 ，进行 PCR 扩增
15、。将 PCR产物送北京博迈德基因技术有限公司测序。将所得的 DNA 序 列 输 入 GenBank（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov）进行 Blast 检索，采用 DNAMAN 软件对所得到的核苷酸序列与 GenBank 中收录的其他相应基因的核苷酸序列进行分析和比对，确定该转化株是否含有 RFP 基因。1.5 RFP标记菌株的荧光稳定性检测选择红色荧光强的菌落，单孢纯化后在不含潮霉素 B 的 PDA 培养基上连续 6 次转接培养，分别于培养 2、5、10d 后通过荧光显微镜进行荧光观察。1.6 RFP 标记菌株的产孢量和致病性检测致病性检测于 2015 年 9 月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验温室进行。用直径 5mm 的无菌打孔器打取活化的转化株菌饼，移接于 PDA 平板上，26培养 15d，使用血球计数板观测转化株的产孢量。对培养 20d 的 2 片真叶期的中农 6 号黄瓜幼苗分别接种转化株和野生型菌株 （阳性对照） ，采用孢子悬浮液喷雾接种法，悬浮液孢子浓度为110
