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1、基于 SRK 基因序列分析的甘蓝自交不亲和 系单倍型鉴定及验证郑 敏 朱陈曾 刘梦慈 徐冰冰 马存发 李勤菲 任雪松 司 军 宋洪元*（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆400715）摘 要：根据甘蓝自交不亲和性雌蕊决定因子 SRK 基因保守序列设计简并引物，克隆 23 份甘蓝自交不亲和系 SRK 基因并测序。利用 NCBI 数据库进行克隆序列的 Blast 比较以及序列之间的相似性分析，初步确定 23 份甘蓝自交不亲和系分属于SRK3、SRK7、SRK8、SRK16、SRK28、SRK36、SRK45、SRK46、SRK58、SRK68 等 1
2、0 种 S 单倍型。其中有 5 份甘蓝自交不亲和系属于 SRK36 单倍型，占参试自交不亲和系的 22%；SRK7、SRK16 和 SRK58 单倍型均只有 1 份甘蓝自交不亲和系。进一步对不同自交不亲和系之间花期杂交后花粉萌发及花粉管伸长情况进行荧光显微观察，并对 20 个杂交组合的花期杂交亲和指数进行调查分析，结果表明根据 SRK 基因序列所确定的相同 S 单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现为不亲和，花粉在柱头上萌发受阻，花期亲和指数低；而不同 S 单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现高度亲和，花粉管伸入雌蕊正常，花期亲和指数高。表明基于 SRK 基因序列分析确定甘蓝自交不亲和系所属单倍型是
3、一种简单而可靠的快速鉴定方法，有利于育种时有针对性地设计甘蓝自交不亲和系杂交组合配制，从而提高育种效率。关键词：甘蓝；自交不亲和性；S 单倍型；SRK 基因glycoprotein） （Steinetal.，1991） 、SCR（S 富 含 半胱氨酸蛋白基因，S-locuscysteinerich）/SP11（S蛋白 11 基因，S-locusprotein11） （Schopferetal.，1999） 。SLG 基因和 SRK 基因在雌蕊柱头中表达，SCR/SP11 基因在雄蕊花药中表达，这 3 个基因紧密连锁，在花粉、柱头识别过程中起重要作用（Kusabaetal.，2000；Takas
4、akietal.，2000；卢军等，2007） ，其中 SRK 基因与 SLG 基因均呈高度多态性，同一 S 等位基因系中的 SLG 基因与SRK 基因在序列上协同进化，因此将这两个基因及其连锁序列合称为一种 S 单倍型（S-haplotype）（Boyes&Nasrallah，1993；Okamotoetal.，2004） 。迄今，芸薹属中已有逾 100 个 S 单倍型被确定，在甘蓝中已经找到了逾 50 个 S 单倍型（Ockendon，2000） 。不同 S 单倍型自交不亲和系之间花期授粉能正常结籽，相同 S 单倍型之间花期授粉不能结籽或结籽率极低。因此，利用不同单倍型的自交不亲和系进行杂
5、种一代配制是目前甘蓝杂种优势利用的重要途径之一。目前，甘蓝育种家通过连续自交、小孢子培郑 敏， 女， 硕 士 研 究 生， 专 业 方 向： 蔬 菜 遗 传 育 种，E-mail：* 通讯作者（Correspondingauthor） ：宋洪元，教授，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：收稿日期：2017-09-25；接受日期：2017-12-24基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0101804） ，重庆市社会事业与民生保障科技创新专项（cstc2015shms-ztzx80005，cstc2015shms-ztzx80007，cstc2015shms-ztzx80009）甘蓝（
6、Brassica oleracea L.var.capitata L.）为十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，由不结球的野生甘蓝经长期栽培演化而来，是世界各地广泛栽培的蔬菜种类之一。甘蓝作为典型的异花授粉作物，具有花期自交不亲和的特性，属于孢子体自交不亲和性植物（sporophyticSI，SSI） （Tantikanjanaetal.，2010） 。自交不亲和系在遗传上由多个复等位基因高度多态性的 S 位点控制（Takasakietal.，2000） 。S 位点基因通常以一个单位遗传给后代，几乎不会发生重组现象，因此 S 等位基因又称作 S单倍型。目前，已经分离到 3 类与该位点连锁的基因：SR
7、K 受体激酶基因（S-locusreceptorkinase）（Nasrallahetal.，1985） 、SLG 糖蛋白基因（S-locus3232研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2018（3） ：32-39养等途径育成大量的自交不亲和系，这些在球形、熟性、抗病性等农艺性状表型不同的自交不亲和系存在相同的 S 单倍型情况。在育种实践中，不同自交不亲和系之间杂交组合配制时除了进行蕾期彻底去雄外，还需同时进行花期杂交，确认参与配组的两个自交不亲和系是否属于同一个单倍型。该方式在一定程度上降低了杂交组合设计的针对性，且田间工作量大。因此，在甘蓝杂交育种工作中进行不同自交不亲
8、和系的单倍型鉴定和分析是非常重要的。早期的自交不亲和系单倍型鉴定和分析方法，如花期亲和指数法（方智远等，1983） 、荧光显微法（张恩慧，1989；陈世儒等，1990） 、免疫测定 法（Kandasamyetal.，1989；Chen&Nasrallah，1990） 、等电聚焦电泳法（Nishio&Hinata，1978）等方法存在易受环境条件影响、操作过程繁琐复杂、应用难度较大等问题（高启国等，2011） ；基 于 DNA 分 子 的 PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism-polymerasechainreaction，限制性片段长度多
9、态性聚合酶链式反应）鉴定法受酶切片段多态性的限制难以准确进行多个单倍型的区分（Nasrallah&Nasrallah，1989；朱利泉和王小佳，2000；张爱芬等，2008） ；根据 SRK 激酶区序列设计 Class 型以及 Class 型引物仅能将不同自交不亲和系分为 Class 型和 Class 型，无法确定相应的 S 单倍型（田磊等，2011） 。随着芸薹属植物自交不亲和性研究的深入，包括甘蓝在内的大量S 单倍型所含的 SLG、SRK 和 SCR 基因序列的确定以及 DNA 测序技术的飞速发展，结合生物信息学分析，使得在基因序列水平上快速鉴定芸薹属自交不亲和 S 单倍型成为可能（李霞等
10、，2015） 。根据 SRK 基因序列比对，甘蓝自交系所属 S 单倍型（高启国等，2011；田磊等，2011；Tianetal.，2013）以及一代杂种所属的 S 单倍型可被确定（苗雯雯等，2013） 。然而，基于 SRK 基因序列分析的单倍型鉴定法是否与传统的花粉管萌发荧光鉴定法、花期亲和指数鉴定法具有一致性仍缺少相应的报道。本试验针对自交不亲和雌蕊决定因子 SRK 基因设计简并引物，对 23 个稳定的甘蓝自交不亲和系 SRK 基因进行 PCR 扩增、克隆测序，获得的SRK 基因序列进行 NCBI 数据库的比对分析以及相互之间的序列比较分析，确定相应自交不亲和系的单倍型；并在此基础上进行相同
11、单倍型之间、不同单倍型之间花期杂交的荧光显微法鉴定以及花期亲和指数鉴定，以期验证基于 SRK 基因序列分析可否快速确定相应甘蓝自交不亲和系所属单倍型，从而实现有计划地设计甘蓝杂交组合，提高育种效率。1 材料与方法1.1 试验材料供试材料为 23 份稳定的甘蓝自交不亲和系（表 1） ，均由西南大学十字花科蔬菜研究所保存提供。2016 年 7 月育苗，8 月定植于西南大学十字花科蔬菜研究所歇马基地。表 1 参试甘蓝自交不亲和系来源及特征特性编号来源品种特征特性来源地282小灰叶扁球型，常规品种中国P1S11/29扁球型，自交系英国G1金春扁球型，一代杂种日本K198131扁球型，自交系日本E3早秋
12、扁球型，一代杂种日本264二灰叶扁球型，常规品种中国B1上黑 - 早扁球型，常规品种中国339中甘 16 号圆球型，一代杂种中国B3上黑 - 早 A扁球型，常规品种中国H1初秋扁球型，一代杂种日本F416大平头扁球型，常规品种中国319寒胜扁球型，一代杂种日本H2初秋 -2扁球型，一代杂种日本333超美扁球型，一代杂种中国N1黑叶中生 1 号扁球型，一代杂种中国342YR 夏晴扁球型，一代杂种日本327YR 冬太郎扁球型，一代杂种日本328夏王 70A扁球型，一代杂种日本A1上黑扁球型，常规品种中国361南坪甘蓝扁球型，常规品种中国F1早秋 -2扁球型，一代杂种日本301Balkan高扁圆型，
13、一代杂种保加利亚299秋王扁球型，一代杂种日本1.2 甘蓝基因组 DNA 的提取分别取甘蓝自交不亲和系植株幼嫩叶片，利用改良的 CTAB 法（王关林等，2014）提取基因组DNA，用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 浓度和纯度，电泳条带单一且分光光度计检测 D260/D280比值在1.82.0范围内的DNA样品为合格样品， 置于-203333研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES冰箱备用。1.3 SRK 基因引物设计及 PCR 扩增根据甘蓝 SRK 基因序列保守区域设计简并引物：SRK-F：5 -TCAAVCAAYAGAACACTT-3 和SRK-R：5 -CTTYATCC
14、TKGTAAAACCAT-3 （引物中 V=A/C/G、Y=C/T、K=G/T） ，由北京六合华大基因科技有限公司合成。利用该简并引物，以 23 份甘蓝自交不亲和系 DNA 为模板，扩增 SRK 基因片 段。PCR 扩 增 体 系（25L） ：10Buffer（ 含Mg2+）2.5L，dNTPs（10mmolL-1）0.5L，上下游引物（50molL-1）各 0.1L，TaqDNApolymerase（5UL-1）0.2L， 模 板 DNA1.0L，ddH2O 补齐 25L。PCR 反应程序：95 5min；95 30s，45 30s，72 1min，30 个循环； 72 7min。获得预期大
15、小的 PCR 产物， 用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像仪系统进行拍照。1.4 目的片段的回收、克隆及测序分析利用 OMEGA 琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收目的片段，连接到 TRKARA 公司的 pMD 19-T 载体上，转化大肠杆菌感受态细胞 DH5，将获得的克隆进行 PCR 鉴定。鉴定后的阳性克隆送北京六合华大基因科技有限公司测序。每份自交不亲和系的SRK 基因片段测定 23 个克隆。1.5 甘蓝自交不亲和系 S 单倍型的确定将获得的各自交不亲和系的 SRK 基因序列在NCBI 数据库进行 Blast 比对，确定相应的单倍型。在此基础上利用在线软件 Multialin 进行相同单倍
16、型以及不同单倍型之间的 SRK 序列比较分析。根据 Tian 等（2013）的报道，设计 PK1/PK4 和 KD4/KD7 两对引物，进一步对 23 份自交不亲和系的单倍型（Class 型、Class 型）进行鉴定。1.6 单倍型的验证分析2017 年 4 月，在西南大学园艺园林学院甘蓝育种基地，根据不同甘蓝自交不亲和系 SRK 基因序列比较确定的 S 单倍型，设计 20 个杂交组合，含相同单倍型、不同单倍型甘蓝自交不亲和系之间的花期、蕾期杂交授粉，并以各自交不亲和系花期和蕾期自交授粉为对照，3 次重复，每重复至少 50朵花 / 蕾。1.6.1 花粉原位萌发的荧光显微镜观察 不同甘蓝自交不亲和系之间花期和蕾期授粉
