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1、26-_ - 一 j 同 全科医学I临床与教育 2 0 1 4年 1 月 第 1 2卷第 1 期 C l i n i c a l E d u c a t i o n o f G e n e r a l P r a c t i c e J a n 2 0 1 4 ，V o 1 1 2 ， N o 1 效抗逆转录病毒疗法治疗2 4 周AI D S 患者 T h l 7 g ll T r e g W 胞 的表达特点 许 文 芳 吴 勇 钟 建平 兰少波 周 建康 吕秋 琼 周 亚娣 陈雪芳 临床 研 究 摘要1 目的 观 察高效抗逆 转录病毒 疗法( H A A R T ) 治 疗2 4 周后 获得
2、 性免疫缺 陷综合征 ( A I D S ) 患 者辅 助性 1 7 ( T h 1 7 ) 细胞和调 节 l k T ( T r e g ) 细胞表达水平的变化。 方法 选取H A A R T ； 疗的4 5 例A I D S 患者 ， 将其按C D 细胞计 数 分成 1 1 0 0 c e l l s Ix l 、 1 0 1 2 0 0 c e l l s Ix l 和2 0 1 3 5 0 c e l l s Ix l - 组 ， 于抗病毒前和抗病毒2 4 周后采集静脉 血 ， 运 用流 式 细胞仪检测 外周血 中C D “T 细胞 、 T h 1 7 和T r e g 胞 的表达水平
3、 ， 并比较分析其相互关 系。 结果A I D S 患者治疗2 4 周 时T h 1 7 细胞在C D T细胞 中的表达 频率为 ( 1 9 1 0 8 4 ) ， 而 治疗前为 ( 1 - 3 l 0 4 5 ) ， 差异 有统计 学意义( f = 3 6 7 ， P O 0 5 ) 。 1 2 方法 1 2 1 仪器与试剂流式细胞仪 ( 由美国B e c k m a n C o u l t e r 公司生产 ) 型号为E P I C S X L 4 一 MC L 型 ， 试剂抗 人C D 4 一 F I T C C D 8 一 P E C D 3 一 P e r c p 、抗人C D 4
4、一 F I T C、 C D 4 一 F I T C C D 2 5 一 P E及 溶 血 剂 等 由 美 国 B e c t o n D i c k n s o n公 司 生 产 ，抗 人 F o x p 3 一 P E c y 5 、抗 人 I L 一 1 7 A P E、 同型对照 、 固定 破膜工作 液 、 破膜缓 冲 液 、 固定剂、 N o r ma l R a t 血清及F l o w C y t o m e t ry S t a i n i n g B u f f e r 等由美国e B i o s c i e n c e 公司生产； 血常规检测仪 为B e c k m a n
5、 G E N S 五分类血液分析仪 ，试剂和质控 均 由美国B e c k m a n 公司生产 。 1 2 2 T 淋巴细胞亚群测定标本采集采集H A A R T 治疗前及治疗2 4 周时患者及健康对照者的标本。用 E D T A 抗凝负压真空采血管采集研究对象外周静脉 血 ， 在6 h 内进行试验。 1 2 C D 4 + 刊术 巴细胞绝对计数取1 0 I I C D 4 一 F I T C C D 8 一 P E C D 3 一 P e r c p 单克隆抗体加入流式上样试管 中， 然后加入5 0 1 全血， 振荡混匀， 室温避光1 0 m i n ， 溶血， 于室温放置1 0 m i
6、n ， 上流式细胞仪检测得C D T 细胞的百分率， 与血液分析仪上的淋巴细胞绝对值 相乘。 1 2 4 T r e g 表达水平检测流式上样试管 中加入细 胞数约为1 X l O q m l 细胞悬液1 0 0 jx l ， 加入C D 4 一 F I T C C D 2 5 一 P E 1 0 Ix l ， 4孵育3 0 m i n 后， 加入1 m l 的固定 破膜工作液旋涡混匀 。避光4 c C 孵育3 0 mi n ， 用2 m l 破膜缓冲液 ， 离心洗涤3 次后 ， 加入 l Ix l R a t 血清， 4 孵育 1 5 mi n 。在反应体系加入2 5 l 抗人F o x p
7、 3 一 P E c y 5 抗体和2 5 l P E R a t l g G 2 a 同型对照， 避光4 孵 育至少3 0 m in ， 用1 m l 破膜工作液离心洗涤3 次， 最后 用5 0 0 Ix l 的F l o w C y t o me t ry S t a i n i n g B u f f e r 重悬 细胞 ， 并上流式细胞仪检测并分析。 1 2 5 T h l 7 表达水平的检测取肝素抗凝的患者外 周静脉血l 0 m l ， 用F i c o ll 密度梯度离心法分离P B M C ， 调整P B MC 密度至2 X l O m l ， 并悬浮于R P MI 1 6 4
8、0 培养 液( 含1 0 胎牛血清， 1 0 0 U m l 青霉素和0 1 n g m l霉 素) 。 取P B M C 悬液( 2 1 O 6 m 1 ) 加入2 4 孔培养板内， 每 孑 L l m l ， 加入佛 波醇乙酯( P MA) 2 0 n g ml 、 离子 霉素 ( 1 p g m1 ) ， 置培养箱 中培养2 h ( 3 7 ， 5 C 0 ： ) ， 再加入 莫能菌素2 n m o l m l ， 培养2 h 。 收集细胞后， P B S 洗3 次， 分为同型对照管和实验管 ，每管各加入C D 4 一 F I T C 1 0 l ， 避光室温孵育1 5 m in ， 加
9、入F I X ( 固定剂) 1 0 0 l 混匀 ， 室温放置 1 5 mi n ， P B S 洗涤 1 次 ， 加人p e r m( 破 膜剂) 1 0 0 l ， 混匀避光室温放置5 m i n 。实验管加入 P E 抗人I L 1 7 m A b 5 l ，同型对照管加入同型对照抗 体I g G P E 5 l ， 混匀室温避光 ， 孵育3 0 m i n 。P B S 洗 涤3 次后 ， 用5 0 0 I x l 的P B S 重悬 细胞 ， 上 流式细胞 仪 检测 。 1 - 3 统计学方法采用S P S S 1 7 0 软件 。计量资料以 均数 标准差( s ) 表示 ， 采用t
10、 检验 ； 用P e a r s o n 进行 相关性分析； 统计概率采用双侧检验。设P 0 0 5 ) ， 而治疗2 4 周 时 三组 问差 异有 统计 学 意义 ( F 分 别= 4 2 3 、 3 3 7 、 6 5 3 ， 尸 均O 0 5 ) 。 3 讨 论 人类感染H I V 病毒后 ，免疫系统遭到持续性损 伤 ， 导致T 淋 巴细胞逐渐耗竭 ， 特别是C D “辅 助性T 细胞进行性减少。C D “T 在正常情况下 ， 人体内T h l 7 和T r e g 在分化和成熟方面互相制约， 保持动态平衡。 T r e g 细胞可抑制T h l 7 细胞 的功能和数量 的扩增 ， 并
11、且两者 在特定 细胞 因子 的刺激 下可 以相互 转化 。 T h l 7 m 胞与T h l 细胞 、 T r e g m 胞 的诱 导分化过程之 间 存在的微妙调节关系网 。它在 自身疫性疾病 、 感染 、 肿瘤等疾病 中发挥着重要作用 。本次研究通过检 测发现 ， A I D S 患者在治疗前C D “T 细胞上 的T h l 7 的 表达频率显著低于健康对照组 ， 而T r e g 细胞的表达频 率显著高于健康对照者， T h l 7 T r e g l L 例与健康对照 组相比也有统计学意义 ， 与文献报道基本一致【 1 1 ， 提 示A I D S 患者 中T h l 7 T r
12、e g 例失衡。 国内外研究认为 ， 抗病毒治疗能够抑制病毒复 制 ， 使病毒载量下降 ， C D “T 细胞 数量减 少 ， 机体产 生C D “T 细胞增多 ，最终T r e g 细胞下降 ， T h l 7 细胞数 量得到复原和再生 ， 逐 步恢 复机体免疫I5 6 】 ， 本 次研 究发现 ， 抗病毒2 4 周后 ， 其C D “T 细胞数 目和T h l 7 、 T r e g 表达水平 、 T h l 7 T r e g l L 例与治疗前相 比 ，差异 均有统计学意义( J p 均 0 0 5 ) ， 说 明抗病毒治疗能有 效提高C D “ T 细胞数 ， 诱导C D “ T 细
13、胞向T h l 7 细胞转 化 ， 逐渐达到T h 1 7 细胞 的恢复 ， 同时下调T r e g 细胞 ， 进而使T h l 7 T r e g t 例逐渐达到恢复。 本次研究结果显示 ， 治疗 2 4 周 时C D “T 细胞基 数 为2 0 13 5 0 c e l l s Ix l 患者组其T h l 7 细胞表达频率 全科医学临床与教育 2 0 1 4 年 1 月 第 1 2 卷第 l 期 C l i n i c a l E d u c a t i o n o f G e n e r a l P r a c t i c e J a n 2 0 1 4 ，V o 1 1 2 ， N
14、o 1 与治疗前 相 比，上调程 度高于1 0 1 2 0 0 c e l l s l l 和 1 1 0 0 c e l l s lx l 组 ， T r e g 细胞表达频率治疗后显著下 降，下降程度2 0 1 3 5 0 c e ll s tx l高于1 0 1 2 0 0 c e l l s tx l 和1 1 0 0 c e l l s l l 组 ， 说 明C D “T 细胞基数高的患者较 基数低的患者具有更强的免疫应答能力 ， 体内免疫 功能的重建较快 ，原因考虑对于C D “ T 细胞基数较 低的患者， 可能会存在不同程度的黏膜屏障的器质 性损伤，这种器质性损伤会导致C D “
15、 T 等免疫细胞 数量或功能逆转缓慢 ，而对C D T 细胞基数较高的 患者， 可较快通过体内C D T 细胞的重新分布， 使外 周 lf l l T h l 7 和T r e g 细胞得到较快重建 。 研究还发现 ，治疗前T h l 7 细胞与C D “ T 细胞数 成正相关， 而T r e g 细胞与c D T 细胞呈负相关， 但治 疗2 4 周时无论是T h l 7 细胞还是T r e g 细胞均与C D T 细胞数无相关性 ， 显然 ， 在疾病进展过程中， C D “T 细胞的急剧减少 ， 可使rI l l 1 7 细胞表达频率减少， T r e g 细胞表达增多， 导致两者免疫失衡， 而T h l 7 T r e g t 例的失衡 ，可能是疾病快速进展 的重要原 因之一。 但在抗病毒过程 中， C D “T 细胞 、 T h l 7 和T r e g 细胞 的 重建速度可能是不一致 的 ， HI V 病 毒载量 的抑 制可 使c D “ T 细胞数量迅速增多， 但其体内免疫功能平 衡的恢复可能是一个持续而缓慢的过程 。
