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1、数 据 由 B a x t e r BioScience疫苗开发 组友情提供。Manfred Reiter和 Wolfgang Mundt工 艺 开 发 , B a x t e r Biomedical研究中心Orth,奥地利大规模微载体培养Vero细 胞生产流感疫苗流行性感冒是一种病毒引起的呼吸系统疾病，在人群中导致高发病率和显著的死亡率。随着20世纪40年代流感疫苗的推广，流感疫苗已经 明显减低了发病率。流感疫苗是三价的，目前的组成含有A型流感病 毒菌株亚型HN、H3N2及B型流感病毒菌株。传统用于疫苗生产的流 感病毒在鸡胚内培养。使用这种传统的方法不得不对几百万个蛋胚逐 一接种和收获。生
2、产过程很难自动化、劳动强度大、时间消耗多，且 有污染的可能。流感病毒能够在多种动物细胞内繁殖, Baxter公司专注于Vero细胞， 一种可传代的猴肾细胞，其特征如表1所述。表1.Baxter的Vero细胞平台背景资料来源:细胞库:从ATCC (美国典型微生物菌种保藏中心) 获得的非洲 绿猴 (Cercopithecus aethiops) 肾细胞ATCC CCL8，988年，传代数为24MCB (主要种子细胞库) 传代数为28 (全面检测为无致 瘤性、无外源因子，同源一致性/遗传学稳定性)WCB (工作种子细胞库) 传代数为33标准质量控制检测项目： - 细菌和真菌无菌检测 - 支原体 -
3、外源因子4Vero细胞在过去的二十多年里已获准用于生 产人用疫苗 (例如脊髓灰质炎和狂犬病疫苗)。 虽然Vero细胞对多种病毒敏感，可是最初流 感病毒在Vero细胞上的努力失败了 (，2)。Baxter Healthcare现已开发出一种能够生产高 效价的季节性流感和禽流感人用疫苗的技术 (表2)，也可以生产大多数其他的人用和兽用疫苗 (表3)。在文献 (3，4，5) 中描述了Vero细 胞技术用于疫苗开发和生产的原理和前景。大流行流感疫苗制备禽流感病毒 (H5N) 向人类的快速传播和蔓延 已经在世界上引起对新流行性病毒的恐慌， 更加担心流感疫苗生产方法和能否快速生产 和储备出足够的疫苗。Ba
4、xter现已开发出一种 成熟稳定并且灵活的生产策略，它使用生长 在Vero细胞中的野生型病毒。野生型全病毒 疫苗诱导和加强包括细胞免疫H5N特异性免 疫应答 (在H5N特异性应答中，疫苗中不含有PR8、核蛋白和膜蛋白)。我们的大规模生产数 据证实了在短期内快速、高产量地生产大流 行流感疫苗是可行的。表2.Vero细胞不同流感病毒株的血凝素效价亚型 宿主 病毒株 血凝素单位HAUHN人类 A/PR/8/34 256人类 A/USSR/90/77 256猪 A/Swine/976/3 256鸭子 A/Duck/Bavaria/2/77 256 人类 A/Singapore/57 28H2N2 人类
5、 A/Hong Kong/68 28猪 A/Swine/HongKong/3/76 28猪 A/Swine/HongKong/27/82 256鸭子 A/Duck/HongKong/24/75 256H3N2鸭子 A/Duck/Singapore/3/97 256H5N3 家禽 256H7N 家禽 A/Quail/Hongkong/G/97 28人类 A/Hongkong/073/99 256H9N2人类 A/Vietnam/94/2004 024人类 A/Vietnam/203/200 024人类 A/SP83/2004 (Thailand) 52人类 A/Indonesia/05/2005
6、 024家禽 A/Turkey/Turkey/2005 024家禽 A/Chicken/Egypt/3/2006 024H5N微载体辅助大规模Vero细 胞技术驯化Vero细胞适应在用于大规模生产的无血 清无蛋白培养基内生长。带有详细传代记 录的Vero细胞冻存管被复苏；并传代到T形 瓶和滚瓶中，生产出足够数量的细胞以接种Cytodex3微载体生物反应器。细胞汇合后， 细胞按照大约:7的比例传代到后面的生物反应器。最终的细胞密度在2-306/ml。中试 生产中最终的生物反应器规模是200升。包 括工艺设计，特殊的通气和搅拌装置，可以 进一步放大到生产体积为6000升。在所有的 生产开发过程中，
7、从小量实验生物反应器到 临床和商业化的生产用反应器，Vero细胞表 现出相同的工艺水平 (表4)。表3.Vero细胞对不同病毒的敏感性流感病毒 (粘病毒)天花ACAM-2000 (痘病毒)SARS Co (冠状病毒)肝炎A病毒 (小核糖核酸病毒)Ross River病毒 (病毒)日本脑炎病毒 (黄病毒)西方尼罗河病毒 (黄病毒)Chikungunya病毒 (病毒)病毒:表4.在Cytodex3上的Vero细胞工作体积和传代水平接种细胞 0.2 0.2* 0.2* 0.2* 38第一个生物反应器 0.7 2.0 24 20 39.5第二个生物反应器 4.6 4.3 70 950 4第三个生物反应
8、器 32 00 200 6000 42.5体积(L) 传代数*多个滚瓶 5ABC图1.在20L (A) 、950L (B) 和6000L (C) 反应器中Cytodex 3 微载体上生长的Vero细胞。Vero细胞大规模生产潜能贴壁依赖性Vero细胞生长达到很高的细胞数，最大规模6000 L的批次培养能获得.803个细胞。商业生产中使用多个并行的生物反应器。Vero细胞在不同规模的生物反应器内贴附 在Cytodex 3微载体上生长的照片如图1所示。Vero微载体细胞培养工艺放大到最大的生产规模中验证有 效，测定了代谢参数如残留葡萄糖和氧消耗速率图。图2提供 了连续运行的实例。020406080
9、00204023660IB/SD97/O/03/07IB/SD97/O/03/0IB/SD97/O/03/400,5,522,533,544,55023456IN/O/03/05IN/O/03/06IN/O/03/07IN/O/03/08IN/O/03/09IN/O/03/0IN/O/03/IN/O/03/2IN/O/03/3IN/O/03/4IN/O/03/5AB葡萄糖(第三个发酵罐)葡萄糖g/l天OUR耗氧速率时间(小时)图2.在最终生产规模为6000升时Vero细胞培养的代谢图。(A) 在多轮运行的灌注培养中代谢的葡萄糖浓度，(B) 在病毒繁殖期的相对氧消耗速率。6ABC图3.大规模流感
10、病毒生产中细胞病变影响图片。(A) 未感染的细胞，(B) 早期细胞病变影响，(C) 收获前的晚期细胞病 变。大规模流感病毒生产工艺为生产病毒，使用42.5代数的Vero细胞接种不同的病毒株，MOI为 0.0TCID50/细胞。病毒吸附小时，然后加入胰酶并在 3235下进一步孵育48-72小时。大流行流感疫苗和季节 性流感疫苗的病毒株都能在这些条件下生长。病毒生产动力 学和细胞病变效应的评估 (图3) 使得我们能够建立一个稳定的 且可重复的生产工艺。大流行流感和季节性流感疫苗的生 产工艺用于生产的病毒株的准备是关键的一步。病毒扩增按三步进 行，命名为病毒种子库、工作库和生产库。这使得我们可以确
11、保一种为商业生产持续和长期的病毒供应。最后，生产病毒库 被用于感染6000升规模的生物反应器生产，紧接着进行许多 已经建立完善的下游单元操作 (图4)。在滚瓶中的接种准备 （代数3338）在Cytodex3微载体上的细胞扩增 （生物反应器步骤、2、3）病毒繁殖 （裂解过程）细胞分离 （收获）灭活 （福尔马林和UV）蔗糖梯度纯化 （纯化）超滤洗滤 （纯化2）制剂和填充 （多种菌株混合）图4.Vero细胞流感疫苗生产 7ABC图5.流感疫苗生产的大规模生产区域。(A) 细胞培养 (B) 离心分离，(C) 超滤、洗滤。微载体上汇合了的Vero细胞，用不同的亚型 病毒株感染，再培养2-3天。用连续流离
12、心收 获和细胞分离澄清，上清液中含有病毒。活 病毒用福尔马林处理并应用UV照射进行第二 步灭活步骤。灭活的病毒进一步通过连续的 蔗糖密度离心纯化 (纯化-) ，去除可溶性的宿 主细胞蛋白。这中间产物称为纯化的病毒， 并含有大约42%的蔗糖浓度。超滤减少蔗糖浓 度并完成精细纯化 (纯化-2) 。这步的最终产物 称为单价疫苗。最后不同的单价疫苗被无菌 混合制剂和填充成最终的疫苗针剂。在图5中 显示6000升规模的发酵、离心和超滤的生产 区域。Vero细胞季节性和大流行 流感疫苗的临床实验数据Vero细胞季节性流感裂解苗和野生型大流行流 感全病毒疫苗已经成功地通过了临床试验。 裂解疫苗最常用于季节性
13、流感疫苗生产。Baxter研究的大流行H5N疫苗，目前在欧洲 已上临床期，使用全病毒工艺进行开发。Vero细胞H5N全病毒疫苗的是安全的，且在 使用550个对象的试验/期研究中有极好 的耐受性图。低至3.75 g或7.5 mg剂量的疫 苗就有高的免疫原性并显示出交叉中和抗3价 毒株 (香港/56/997) 和一种最近的2价毒株 (印度尼西亚/05/2005)。使用季节性候选裂解病毒疫苗在欧洲临床试 验/期研究中得到的数据显示出很强的抗 体应答和良好的耐受性。设计了多中心研究 来评估候选疫苗在对象中的安全性和免疫原 性，大约有940个年龄分布在8-49岁和50岁 以上之间的对象。在8-49岁年龄
14、的对象人口 中，99.6%的对象获得针对病毒毒株H1N1和 H3N2的保护性抗体水平，92.9%获得针对B毒 株的抗体。在50岁以上的人口中，96.6%的 对象获得针对病毒毒株H1N1的保护性抗体水 平，73.3%获得针对B毒株的抗体。概要相对于传统的基于鸡蛋孵育的技术，用微载 体Vero细胞技术生产流感病毒疫苗具有许多优 点。我们已经示例证明了不光是Vero细胞培养 工艺而且包括相关的失活和纯化步骤的成功的 放大。使用一个Vero细胞种子和工作细胞库系 统使得细胞接种培养不需要推迟就可以进行准 备。放大达到多个6000升生物反应器提供了 两次流感爆发之间病毒的稳定的高产量生产， 并能够对出现的全国流行性病毒变异株作出快 速的反应。在随后和Marc van Regenmortel博 士会面讨论关于疫苗工业所面临的挑战中，将 讨论生物传感器对新疫苗开发和生产的贡献。8
