分离名词解释

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1、10 蛋白质复性包含体（inclusion body) 重组蛋白质的高表达常常导致其在细胞内发生错误折叠和聚集， 形成被成为包含体的聚集体。包含体主要由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物，这些基因表达产物的一级结构是 正确的，但立体结构是错误的，没有生物活性。 以包含体形式表达的蛋白质，需要在回收后溶解，使其肽链伸展（unfolding)，然后在合 适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。这一过程称为蛋白质的体外再折 叠（refolding）或复性（renaturation）。10.1.1 包含体的形成氨基酸顺序决定了蛋白质的立体结构。理论上蛋白质折叠成天然活性状态是自发完成的，

2、但伸展的肽链折叠成立体结构的过程受周围环境的影响。包含体是在表达产物翻译后立即形成，包含体内的表达产物具有部分二级结构。 一般认为包含体的形成是部分折叠的中间态（intermediates)之间疏水性相互作用的结果， 主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、 离子组成）不适或缺少某些折叠辅助因子（如分子伴侣）的作用。 在大多数情况下，包含体的形成是蛋白质过量表达的结果，而与蛋白质种类和表达系统无 关。对于任何蛋白质和任何表达系统，在过量表达的情况下都可能形成包含体。 活性产物 N 的形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓度成正比；聚集体 A 的形成反应在分 子

3、间发生，反应速率与浓度的高次方成正比，即反应级数2。因此如果新生肽折叠成天然 活性蛋白质的速度缓慢，新生肽浓度增加和中间态的疏水性相互作用就可能导致包含体的 形成。外源基因基因表达产物在原核细胞中易于形成包含体，许多蛋白质药物的生产依赖于蛋白 质复性技术的提高。蛋白质的错误折叠和聚集还可能与许多重要疾病（如阿尔茨海默症、疯牛病、帕金森症等） 有关。10.1.2 包含体的性质较大的包含体由于其折光性的不同，可以在显微镜下观察，所以包含体又称光折射体。以包含体形式表达重组蛋白质具有一定优势：1、包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核细胞表达系统中形成，有利于大规 模生产目标蛋白质；2、一般包

4、含体蛋白质的表达量都很高；3、包含体富含目的基因表达产物，有利于后续的分离纯化；4、沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解；5、对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物，以包含体形式表达 是最可取的生产途径。10.1.2 包含体的体内抑制如果能有效地进行蛋白质的体外复性，可充分发挥包含体蛋白质表达系统的优势。有效蛋白质很难进行体外复性，特别是相对分子质量较大，结构复杂和含有较大二硫键的 蛋白质，此时应抑制包含体的生成，提高可溶性蛋白质的表达量。方法：降低细胞培养温度，减缓蛋白质的表达速度和降低表达量；将目标蛋白质与分子伴 侣蛋白、折叠酶和二硫键异构酶共表达，弥补外源蛋白质表

5、达过程中缺乏的辅助因子；使 用非代谢性碳源降低代谢速度和蛋白质表达量；将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达10.2.1 包含体的分离纯化蛋白质复性过程包括包含体的分离纯化、包含体的溶解已经复性等步骤。包含体的分离从细胞破碎开始，以离心沉降或膜分离方法分离回收包含体。包含体纯度对复性收率影响显著，为实现较高的蛋白质复性收率，必须进行包含体的纯化， 除去质粒 DNA、脂多糖和其他蛋白质，降低蛋白质的聚集体生成速率，促进复性方向向正 确折叠的方向进行。包含体分离纯化的一般过程：1、细胞破碎：为提高下一步的离心效果，需进行高强度的破碎。2、离心沉降回收包含体：较高转速下除去可溶性组分和沉降速度较小的细胞

6、碎片，回收 沉降的粗包含体。3、粗包含体的洗涤：加入螯合剂 EDTA 及低浓度变性剂或表面活性剂，溶解吸附在包含 体表面的磷脂和膜蛋白质。4、离心沉降回收包含体。10.2.2 包含体的溶解获得适当纯度的包含体后，需溶解包含体，是目标蛋白质肽链伸展，为进一步的复性创造 条件。通常用高浓度的强变性剂溶解包含体。溶解的包含体蛋白质中仍会有一些杂质存在，如蛋白质、核酸和细胞膜组分等。为提高复 性收率，在复性前可对变性/还原的蛋白质进一步纯化。主要 纯化方法有凝胶过滤色谱、 离子交换色谱、反相色谱和固定化金属离子色谱等。纯化操作中要保持蛋白质的溶解状态，还可将变性蛋白质交换到酸性溶液中，冻干保存。 复性

7、前重新溶解。10.3 蛋白质复性降低变性剂浓度至非变性范围内可引发变性蛋白质的重折叠复性。对含有二硫键的蛋白质， 其复性过程需要添加氧化剂和还原剂，条件复性液的氧化还原环境，促进正确二硫键的形 成。一般认为疏水性作用在蛋白质折叠过程中发挥主要作用。蛋白质复性的主要挑战是创造适宜的复性条件，最大程度地抑制聚集体的生成，提供复性 收率。现有的主要复性方法：稀释复性、添加剂辅助复性、分子伴侣或人工分子伴侣辅助复性、 反胶团的应用、色谱柱复性等。10.3.1 稀释复性稀释复性是最简单和最常用的传统复性方法，根据具体操作模式又分为直接稀释复性、透 析（或洗滤）复性和流加复性等。直接稀释复性：将变性蛋白质

8、溶液直接稀释到适宜的复性缓冲液中。变性剂浓度降低，伸 展肽链迅速折叠成中间体 I。复性过程可简化为中间体 I 折叠成天然活性态 N 和生产聚集 体 A 的平行反应。10.3.1 稀释复性聚集体的生成速率与蛋白质浓度的高次方成正比，浓度越高，聚集体生成速度越快，复性 收率越低。降低蛋白质浓度有利于获得较高的收率。为提高收率，通常要在较低的浓度下进行蛋白质复性操作，但降低蛋白质浓度会增大复性 液的体积，为后续的分离纯化增加困难。10.3.2 辅助因子的作用在稀释复性中添加各种小分子溶质，以抑制聚集体的生成。利用辅助因子的稀释复性方法 又称稀释添加复性。许多小分子溶质具有促进蛋白质复性的作用，最常用

9、的是低浓度变性剂；其他辅助因子有： 精氨酸、甘油、聚乙二醇、各种表面活性剂。一般认为辅助蛋白质复性的添加剂主要有两种作用：稳定天然态蛋白质的结构，降低错误 折叠蛋白质的稳定性；提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度（稳定性）。利用稀释添加剂应注意：添加剂辅助蛋白质的作用具有选择性。对于稳定折叠中间体或伸展肽链的添加剂，其辅助作用存在最佳浓度或浓度范围。添加剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度有关。利用添加剂提高复性收率的同时，会降低蛋白质的折叠复性速率，增加复性时间。11 结晶1 结晶的概念结晶是从液相或气相生成形状一定、分子（或原子、离子）有规则排列的晶体的现象。固体有结晶和无定形两种状态结晶

10、：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则无定形固体（沉淀）：析出速度快，粒子排列无规则2 结晶操作的特点只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的 晶体。结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便3 结晶原理饱和溶液：当溶液中溶质浓度等于该溶质在同等条件下的饱和溶解度时，该溶液称为饱和 溶液；过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；溶质只有在过饱和溶液中才能析出；大多数物质的溶解度随温度的升高显著增大，也有一些物质的溶解度对温度变化不敏感， 少数物质的溶解度随温度

11、升高而显著下降。温度与溶解度的关系由于物质在溶解时要吸收热量、结晶时要放出结晶热。因此，结晶也是一个质量与能量的 传递过程，它与体系温度的关系十分密切。溶解度是温度的函数，溶质在特定溶剂中的溶解度常用温度-溶解度曲线表示，又称饱和曲 线。4 过饱和溶液与介稳区稳定区和亚稳定区各区域的结晶现象：A 稳定区，即不饱和区，此区域内即使有晶体存在也会自动溶解B 第一介稳区，即第一过饱和区，此区域内不会自发成核，但加入结晶颗粒时结晶会生长， 但不会产生新晶核，加入的结晶颗粒称为晶种C 第二介稳区，即第二过饱和区，此区域内也不会自发成核，但加入晶种后，在结晶生长 的同时会有新晶核产生D 不稳定区，是自发成

12、核区域，瞬时出现大量微小晶核，发生晶核泛滥在温度-溶解度关系图中，曲线 1 下方为稳定区，在该区域任意一点溶液均是稳定的；而在曲线 1 和曲线 3 之间的区域为亚稳定区，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核）， 溶液可长时间保持稳定；加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并降至曲线 1；介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可以进一步划分刺激结晶区（第二 亚稳区）和养晶区（第一亚稳区）不稳定区在曲线 3 的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任意一点溶液均能自发形成结晶，溶液 中溶质浓度迅速降低至曲线 1（饱和）；晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度便降至饱和溶解度，此时

13、已形成大量的细小结 晶，晶体质量差；不稳定区结晶产品质量难于控制，而且结晶回收困难。因此，工业生产中通常采用加入晶种，结晶操作均在介稳区内进行，主要在第一介稳区， 将溶质浓度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。5 影响溶液过饱和度的因素饱和曲线是固定的不饱和曲线受搅拌、搅拌强度、晶种、晶种大小和多少、冷却速度的快慢等因素的影响结晶过程的实质结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程这一过程包括：溶质分子凝聚成固体和分子有规律地排列在一定晶格中这一过程与表面分子化学键力变化有关；因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。6 结晶的步骤（1）过饱和溶液的形成（2）晶核的形成（3）晶体生长其

14、中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。7 过饱和溶液的形成热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同时，溶解度随温度变化的幅度要适中；自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）部分溶剂蒸发法（等温结晶法）适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度升高 溶解度降低的体系；加压、减压或常压蒸馏真空蒸发冷却法使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种 结晶方法。 设备简单、操作稳定8 成核在一定过饱和度下存在临界晶体半径 rc， 半径大于 rc 的晶体生长，半径小于 rc 的晶体 溶

15、解消失。理论上通常将半径为 rc 的结晶微粒定义为晶核，而将半径小于 rc 的结晶微粒称为胚种。晶核的成核速度定义：单位时间内在单位体积溶液中生成新核的数目。是决定结晶产品粒度分布的首要动力学因素；成核速度大：导致细小晶体生成，因此，需 要避免过量晶核的产生9 常用的工业起晶方法自然起晶法：溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶 液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。刺激起晶法：将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时 溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。晶种起晶法：将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较

16、低浓度，加入一定量和一定大小的晶种， 使溶质在晶种表面生长。该方法容易控制、所得晶体形状大小均较理想，是一种常用的工业起晶方法。10 影响晶体生长速度的因素杂质：改变晶体和溶液之间界面的滞留层特性，影响溶质长入晶体、改变晶体外形、因杂 质吸附导致的晶体生长缓慢；搅拌：加速晶体生长、加速晶核的生成；温度：促进表面化学反应速度的提高，增加结晶 速度；11 提高晶体质量的方法晶体质量包括三个方面的内容：晶体大小、形状和纯度影响晶体大小的因素：温度、晶核质量、搅拌等影响晶体形状的因素：改变过饱和度、改变溶剂体系、杂质影响晶体纯度的因素：母液中的杂质、结晶速度、晶体粒度及粒度分布重结晶：是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的 溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。11.5.1 结晶操作特性增大溶液过饱和度可提高成核速率和生长速率，但过饱和度过大影响结晶质量本章作业结晶操作的原理是什么？饱和溶液和过饱和溶液的概念凯尔文公式的内容和意义是什么？ 结晶的一般步骤是什么？过饱和溶液形成的方法有哪些？绘制饱和温度曲线和过饱和温度 曲线