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1、分子印迹技术及其研究进展分子印迹技术及其研究进展 MalikullidinMalikullidin iziz kalduruxkaldurux tehnikisitehnikisi wawa uninguning tarakkiyatitarakkiyati 分子印迹技术分子印迹技术近年来分子印迹学作为一门新兴的科学门类得到巨大的发展。分子印迹技术是一种模拟抗体- 抗原相互作用的人工生物模板技术。它可为人们提供具有期望结构和性质的分子组合体，因此，分子印迹技术已成为当今化学研究领域的热点课题之一。分子印迹的出现源于免疫学，早在 20 世纪 40 年代由诺贝尔奖获得者Pauling 根据抗体与抗
2、原相互作用时空穴匹配的“锁匙”现象，提出了以抗原为模板来合成抗体的理论。直到 1972 年德国科学家 Wulff 18研究小组首次成功制备出分子印迹聚合物，使这方面的研究得到了飞速的发展。1993 年 Mosbach 19研究小组在美国自然杂志（Nature）上发表有关分子印迹聚合物的报道，更加速了分子印迹在生物传感器20-24、人工抗体模拟25及色谱固定相26-30分离等方面的发展，并由此使其成为化学和生物学交叉的新兴领域之一，得到了世界注目并迅速发展。分子印迹技术的应用研究所涉及的领域非常广泛，包括环境、医药、食品、军事等。 1.1.分子印迹技术的基本原理及特点分子印迹技术的基本原理及特点
3、分子印迹聚合物是具有特定功能基团以及孔穴大小和形状的新型高分子材料。是具有高度交联的结构，稳定性好，能够在高温、高压、有机溶剂以及耐酸碱的分子识别材料。它的制备是通过以下方法实现的：首先用功能单体(functional monomer)(funkissial tana)和模板分子（template）(izi kaldurlidigan malikulla)以共价键或非共价键形成复合物,再加入适当的交联剂(cross-linker)(tutaxturguqi)和引发剂在加热、紫外光或其它射线照射的条件下聚合, 从而使模板分子在空间固定下来；最后通过一定的方法把模板分子洗脱,将模板分子从聚合物中除
4、去, 这样就在聚合物中留下一个与模板分子在空间结构上完全匹配，并含有与模板分子结合的功能基的三维空穴(simtirik kawakqa)。这个三维空穴可以重新专一的,高选择的再和模板分子结合,从而使该聚合物对模板分子具有专一的识别功能。分子印迹技术具有以下特性:预定性,可根据不同目的制备相应的分子印迹聚合物;识别性, 分子印迹技术是依据模板定做的,它具有与模板分子的立体结构和官能团相符的孔穴,所以选择性地识别模板分子;实用性,它可以与天然的生物识别系统如酶与底物、抗原与抗体等相媲美,具有抗恶劣环境、稳定性高和使用寿命长等优点。分子印迹技术由于具有亲合性和选择性高、抗干扰性强和稳定性好、使用寿命
5、长、应用范围广等特点，因此，在色谱分离(hirmotografiyelik ayrix)、固相萃取(mukim fazilik ikistirakitlax)、仿生传感(taklidxunaslik)、模拟酶催化、临床药物分析、吸附、膜分离等领域，得到日益广泛的研究和开发31-37。此外，分子印迹技术对于研究酶的结构、认识受体一抗体作用机理以及在分析化学等方面也具有重要的理论意义和实用价值分子印迹技术受到了人们越来越多的关注,其研究和应用获得了迅猛发展。近年来,国内外对分子印迹技术的应用已有很多文章。2. 分子印迹聚合物的制备方法在分子印迹聚合物的制备过程中所需要的化学药品包括：能与模板分子形
6、成复合物的功能单体，交联剂，致孔剂（溶剂），引发剂，冲洗模板分子用的溶剂。2.1 模板分子模板分子合成分子印迹聚合物时，模板分子与功能单体在聚合前需形成复合物，复合物(murakkap birikma)必须足够稳定才可在聚合过程中形成大量特异性识别位点。2.2 功能单体功能单体单体的选择主要由印迹分子决定，而且对分子印迹聚合物的识别性能影响很大。功能单体首先必须能与印迹分子以共价键或非共价键（ 氢键、静电作用力、金属螯合作金属螯合作用力用力、分子间作用力、基团之间作用力以及疏水作用等) 形成复合物，而且键合空穴要稳定，在反应中与交联剂处于合适的位置，交联度要适当才能使印迹分子恰好镶嵌其中。因此
7、，功能单体的性质、用量、交联度等对印迹聚合物的识别性能产生很大影响。分子印迹聚合物根据模板分子与功能单体在聚合过程中相互间作用力类型的不同，可分为共价型和非共价型38。常用的功能单体有：非共价性的单体主要有丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸（MAA） 、三氟甲基丙烯酸（TFMAA） ，其它的还有甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸异辛酯、丙烯酞胺及 N-（4-乙烯苄基）亚氨基二乙酸铜（II）等。2.3 交联剂交联剂交联剂的作用是使模板分子和功能单体形成高度交联、刚性的聚合物，固化单体功能基团在模板分子周围的特定位置。选择功能单体的前提条件是：要求在聚合时能够保证体系中所有组分包括单体，交联剂，
8、单体和模板等所形成的非共价印迹保持完好不变。交联剂的选择中，在有机溶剂中进行分子印迹聚合物试验，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）以及二乙烯基苯(DVB)是最常用的交联剂。除此之外，三丙烯酸季戊四醇酯(PETRA)、三甲醇基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）等。而在水相中常用的典型交联及是N,N-亚甲基双丙烯酰胺。目前用最为广泛的是 EDMA。2.4 溶剂（致孔剂）溶剂（致孔剂）溶剂应该能够溶解聚合反应中所需的各种试剂。除此之外溶剂还有一个非常重要的作用，即为印迹整体柱提供多孔结构。溶剂的选择对聚合过程中分子印迹聚合物的均一性和非共价作用影响很大39，对分子识别能力也有影响：极性大的溶剂可与模板分子
9、竞争单体的功能基团，降低了特异性识别位点的形成；不同溶剂的溶解性质不同，影响网状结构的形态、识别位点处功能基团的定位及位点的可达到性。致孔剂的作用是使聚合物具有孔状结构，便于待测物进入识别位点。目前常用的致孔剂有：甲苯、乙腈、氯仿、环己醇、1，4-丁二醇、正十二醇等。2.5 引发方式和引发剂引发方式和引发剂分子印迹聚合物的合成主要采用自由基聚合的方法，而引发方式常用的有热引发和光引发两种方式。热引发聚合常在4560或更高的温度下进行。光引发聚合是在室温或低温时，UV 照射下进行。低温可以增强模板分子单体复合物的稳定性，合成的分子印迹聚合物特异性识别能力较强40，但当模板分子有强烈紫外吸收或光降
10、解时，热引发方式是必要的：并且光引发方式在聚合过程中对温度不易控制。目前常用的自由基引发剂有偶氮二异丁腈（AIBN） 。2.62.6 共价印迹法和非共价印迹法共价印迹法和非共价印迹法根据功能单体和模板分子之间形成的加成物性质，存在着两种形式的分子印迹法，即共价印迹法和非共价印迹法。共价印迹法共价印迹法共价型分子印迹聚合物最初是由 Wullf 及其合作者41提出，聚合前模板分子通过可逆性共价键与功能单体结合，然后与交联剂在一定条件下聚合，聚合完成以后再通过化学方法使共价键断裂以除去模板分子。该方法又称为预组织法或预组装法(preorganization approach)。目前，这种方法主要适用
11、于包括一些糖类及其衍生物、甘油酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物等化合物的印迹。优点：单体模板所形成的配合物十分稳定，而且相互之间存在着计量关系。由于配合物的稳定性可在高温，较宽酸度范围，高极性溶剂中进行聚合。然而，一方面，共价作用结合和解离的过程进行缓慢，对色谱分离不适用；由于找到易于解离和再结合的共价键比较困难，共价型分子印迹聚合物有很大的局限性。非共价印迹法非共价印迹法为使功能单体和模板分子相结合，通过非共价的相互作用（如氢键静电相互作用以及配位键的形成等）也可加以实现。Mosbach 及其合作者42首次将非共价型分子印迹聚合物引入分子印迹技术。聚合前模板分子通过氢键、静电作用力及疏水作用等
12、与功能基体结合形成超分子复合物。关于这种类型分子印迹聚合物的制备和应用报道很多，包括一些染料、二胺类、维生素、氨基酸及其衍生物、多肤等。制备非共价型分子印迹聚合物对模板分子和功能基体限制较少，模板分子容易除去，而且选择性好。近年来，非共价法己经成为分子印迹聚合物材料的主要使用方法，该方法也称为自组装法(self-assembly approach)。优点：这种方法制备步骤简单，模板分子易于除去，其识别过程也更接近于天然的分子识别系统，不必合成共价的单体-模板配合物。由于单体-模板之间存在着较弱的非共价相互作用力，可在温和条件下将模板从聚合物中除去。然而，由于单体-模板加成物易于变化，无严格的计
13、量关系，因此印迹过程的轮廓不够清晰。3.3.制备方法制备方法分子印迹聚合物的种类繁多，对于不同的模板分子选用的功能单体、交联剂、溶剂、引发方式和制备步骤也不相同。目前MIP的合成方法有本体聚合法（bulk polymerization） 、多步溶胀法（multi-step swelling and polymerization） 、悬浮聚合法（suspension polymerization） 、沉淀聚合法（precipitation polymerization） 、表面印迹法和原位聚合法（in situ polymerization）等。分子印迹聚合物的研究普遍采用本体聚合的方法，即将印
14、迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在惰性溶剂（通常是氯仿或甲苯）中，然后移入一玻璃安培瓶中，采用超声脱气，通氮气除氧，在真空下密封安培瓶，经热引发（60）或紫外光照射（在室温下波长通常为366nm）引发聚合24h(得到块状聚合物，再经粉碎、研磨和筛分，得到适当大小的粒子，洗脱除去印迹分子，经真空干燥后即成。此方法制备的MIPs 具有满意的“记忆功能”对印迹分子有良好的选择性和识别特性，而且合成操作条件易于控制，实验装置简单，便于普及。但此方法的缺点是，需要经过研磨、筛选得到适合装填色谱柱的颗粒，费时并造成浪费较多。而且由于聚合物颗粒的尺寸和形状不均匀等原因，影响柱效和分离效果。而悬
15、浮聚合法往往需要加入水作为分散剂，不适合水溶性的印迹分子的印迹合成。目前分子印迹整体柱利用原位聚合在色谱柱内形成完整连续的固定相柱床，它结合了分子印迹技术的预定识别选择性和整体柱制备简单、多孔性好、可以进行高速、高效分离的优点，受到了研究者的关注43-46。我们课题组以不同的药物为模板分子，合成了分子印迹聚合物，合成结果来看，合成条件的选择对于分子印迹聚合物的选择性及柱效起着非常重要的作用47-49。其中模板-单体比例，交联剂-单体比例，单体总量与致孔剂比例，聚合温度等在提高分子印迹整体柱选择性的研究中，有两个关键问题：一是聚合物中是否形成了能特异识别模板分子的位点；二是分析过程中的模板分子能
16、否接近这些位点，并与之产生特异性识别。后者与孔结构有关。而前者与分子印迹聚合物的形成过程及分子识别过程密切相关，很多学者对此进行了深入研究前。4.4.评价分子印迹的参数评价分子印迹的参数分子印迹聚合物性质的表征到目在不同的应用领域,可以有不同的表征方法。例如在色谱固定相、手性分离和固相萃取应用中,一般用分离因子 、分离度 Rs 、保留时间tR 、结合常数KD 、离解常数Ka 、富集系数等来表征分子印迹聚合物的选择性的好坏;而在化学传感器的应用中,则需要借用各种电化学参数如电流、电容、电导、电压以及各种光学参数和质量参数如光强度和质量等来表征。5.5.分子印迹技术的应用分子印迹技术的应用分子印迹色谱分离技术中主要是用分子印迹聚合物作为色谱分离的固定相, 以建立固相萃取、高效液相色谱或毛细管电泳分析法进行手性物质的分离, 也可以用于样品的预处理。MIP 作为 HPLC 固定相的应用鉴于 MIP 的特异性识别能力,可将其作为高效液相色谱的固定相来分离手性和非手性药物。由于 MIP 和印迹分子在几何形状上
