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1、 细菌基因组细菌基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱型）提取试剂盒（离心柱型） GK1070 10 PrepsGK1070 10 Preps GK1071 50 Preps GK1072 100 Preps GK1073 20 PrepsGK1073 20 Preps 一一. .试剂盒组成试剂盒组成 ComponentsComponents GK1070GK1070 10 Preps10 Preps GK1071GK1071 50 Preps GK1072GK1072 100 Preps GK1073GK1073 20 Preps20 Preps GenClean Column 2.0-ml C
2、ollection Tube Digestion Solution(a) Wash Solution(b) PB Solution Ext Solution Elution Buffer(c) TE(pH8.0) Boiled RNase A Proteinase K(d) Lysozyme(e) SP Buffer protocol 10 10 4 ml 2.4 ml 3 ml 3 ml 2 ml 2 ml 50 l 30 l 6 mg 1.0 ml 1 50 50 25 ml 12 ml 20 ml 20 ml 10 ml 15 ml 240 l 250 l 30 mg 1.0 ml 1
3、100 100 50 ml 24 ml 40 ml 40 ml 20 ml 25 ml 480 l 500 l 60 mg 1.0 ml 1 20 20 10 ml 12 ml 8 ml 8 ml 10 ml 15 ml 120 l 100 l 15 mg 1.0 ml 1 (a) Digestion Solution 低温时可能出现沉淀，请于 55适当加温溶解后使用，不会影响实验结果。 (b) 首次使用前， 必须在 Wash Solution 瓶中加入 4 倍体积的无水乙醇， 充分混匀后使用。 每次使用后将瓶盖盖紧， 以保持 Wash Solution中的乙醇含量。如果发现 Wash Sol
4、ution 由于运输或保管不当造成体积严重不准，请用量筒定容后再加入 4 倍体积的无水乙醇。 (c)Elution Buffer 为 2.5 mM Tris-HCl, pH8.5，请 4保存。TE (pH8.0) 或者水（pH7.0）均可以使用，但是 DNA 的洗脱效率通常要低20%左右。 (d)不得将 Proteinase K 直接加到 Digestion Solution 中，以免酶失活。 (e) Lysozyme 使用前加入 50l(GK1070)、500l(GK1071)、1ml(GK1072)或 200l (GK1073)SP Buffer，使 Lysozyme 全部溶解。分装后-2
5、0冻存。 客户自备：PBS 缓冲液，胰蛋白酶，无水乙醇 运输运输 储存温度储存温度 运输 室温 储存 Proteinase K , Lysozyme , Boiled RNase A : -20 其他 室温 二主要用途二主要用途 从各种培养细胞和细菌中小规模抽提基因组 DNA。 三主要特点三主要特点 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在 50 分钟内完成。 4.多次柱漂洗确保提取细菌基因组的高纯度，OD260/OD280 典型的比值达 1.71.9，长
6、度可达 50Kb100kb，可直接用于 PCR， Southern-blot 和各种酶切反应。 四培养细胞与细菌样品准备四培养细胞与细菌样品准备 1培养细胞的准备 (1) 对于悬浮培养细胞： 1,000g 室温离心 5 分钟，彻底去除上清。 (2) 对于单层培养细胞：吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞。当细胞从培养瓶表面脱落以后，将细胞转移到离心管中，1,000g 室温离心 5 分钟，彻底去上清。 (3) 将离心去上清的细胞用 150l TE(pH8.0)悬浮。 处理细胞可达处理细胞可达 1106 61108 8个，增加处理细胞数量，请相应增加处理时间。个，增加处理细胞数
7、量，请相应增加处理时间。 2细菌样品的准备 (1) 将适量的指数生长期细菌（最多可达 1109细菌，约 1ml 过夜培养菌液），8,000rpm，离心 1 分钟，彻底弃净培养基。 (2) 加入 150l TE(pH8.0)悬浮细菌，按照下表中的要求加入 Lysozyme 溶液，用吸头混匀，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。 革兰氏阴、阳性菌所用溶菌酶浓度与酶解时间表 TE 中溶菌酶浓度中溶菌酶浓度 加入加入 Lysozyme 体积体积 室温下酶解时间室温下酶解时间 革兰氏阴性菌 400ug/ml 1ul 或不加 35 分钟 革兰氏阳性菌 3mg/ml 8ul /1
8、50ul 悬液 510 分钟 五操作步骤五操作步骤 1. 在按准备方法制备的 150l TE 悬浮样品中，加入 300l Digestion Solution，混匀；加入 4l RNase A 混匀，55保温 10 分钟；再加入 4l Proteinase K， 55保温 1030 分钟。 注意：注意：(1)应按次序加入，不得将应按次序加入，不得将 Proteinase K 先加入先加入 Digestion Solution，再加到样品中。，再加到样品中。 (2)保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品，保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品，55保温保温 1010 分钟足以使细胞裂解，释放出基
9、因组分钟足以使细胞裂解，释放出基因组 DNA。降解完全的降解完全的样品应是透明液体。样品应是透明液体。 2. 如获得的裂解液粘稠度较低，则直接添加 300l PB Solution，充分摇动混匀，12,000rpm 室温离心 5 分钟，将上清全部转移到套放于 2ml 收集管内的 GenClean 柱中。 注意：注意：(1) 如获得的裂解液过于粘稠，则依次添加如获得的裂解液过于粘稠，则依次添加 300l Ext SolutionExt Solution 以及以及 300ul PB solution300ul PB solution 充分摇匀，充分摇匀，12,000rpm12,000rpm 室温离
10、心室温离心5 分钟，上层溶液为蓝色，基因组分钟，上层溶液为蓝色，基因组 DNA 存在于下层溶液中，两层中间可能会有一些沉淀物。存在于下层溶液中，两层中间可能会有一些沉淀物。然后用然后用 1ml Tip 头头伸到下层，将伸到下层，将下层溶液下层溶液全部转移到套放于全部转移到套放于 2ml 收集管内的收集管内的 GenClean 柱中柱中，注意尽量不要吸到上层溶液和中间层沉淀，注意尽量不要吸到上层溶液和中间层沉淀。 (2) (2) 加入加入 Ext 和和 PB 溶液后溶液后，一定要用力充分摇匀，否则后面离心时杂质不容易分层。，一定要用力充分摇匀，否则后面离心时杂质不容易分层。 3. 8,000rp
11、m 室温离心 1 分钟。取下 GenClean 柱，弃去收集管中的废液。 4. 将 GenClean 柱放回收集管中，加入 500l Wash Solution，8,000rpm，室温离心 1 分钟。取下 GenClean 柱，弃去收集管中的废液。 5. 重复步骤 4 一次。 6. 将 GenClean 柱放回收集管中，12,000rpm，室温离心 1 分钟，以去除残留的 Wash Solution。 注意：注意：此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇而影响后续的实验效果。此步骤高速空离是为了去尽残留的乙醇，请勿省略，否则可能因所纯化的核酸中残留有乙醇
12、而影响后续的实验效果。 7. 将 GenClean 柱放入新的洁净的 1.5ml 离心管中，在 GenClean 柱中央加入 50100l Elution Buffer，室温或 37放置 2 分钟。 注意：注意：(1)为提高洗脱效率，可以将为提高洗脱效率，可以将 Elution Buffer 预热到预热到 5580。 (2) 如果样品中基因组如果样品中基因组 DNA 含量很低含量很低，用，用 30l Elution Buffer 洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。 8. 12,000rpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA
13、。根据用途，样品可以4或-20保存。 注：注：重复步骤重复步骤 7 78 8，将洗脱液再次加入到吸附膜上，重新洗一次，将洗脱液再次加入到吸附膜上，重新洗一次，可以提高产率可以提高产率 10%10%20%。 9. 用分光光度计测量 DNA 含量按 1OD260=50g/ml 基因组 DNA 定量并标记。进行 0.7%琼脂糖凝胶电泳判定 DNA 的完整性，也可以判定样品中是否有 RNA。本试剂盒抽提的 DNA长度可达 100kb 以上。 六储存六储存 常温储存一年。 七七问答问答 Q Q- -1 1 基因组基因组 DNA 得率低或无基因组得率低或无基因组 DNA A A- -1 1 一般情况下，从
14、 100l-1ml 过夜培养的大肠杆菌中，可以提取 1-10g 的基因组 DNA，推荐的菌液量是用 500l 的过夜培养的浓菌液。我们不建议用过多的菌液，可能导致溶液不足而降低所提 DNA 的质量。基因组 DNA得率较低时可从一下几个方面考虑： 1.DNA 未充分释放，保证在 TE 中充分悬浮菌体，注意不要残留菌体，加入 Digestion Solution 充分混匀。 2.溶菌酶失活，溶菌酶要用附带的 SP buffer 配制，用水或碱性的 TE 配置的溶菌酶不能长期保存。配制好的溶菌酶最好分装成小份于-20保存。 3.Proteinase K失活，proteinase K起到酶解细菌的作用
15、，该酶失活后细菌裂解效率将大大降低。 4.洗脱时将灭菌水或 Elution Buffer 加热至 65后使用将有利于提高洗脱效率。 5.严格按照操作方法进行操作有利于提高基因组 DNA得率。 Q Q- -2 2 提取的基因组提取的基因组 DNA 有降解，为什么？有降解，为什么？ A A- -2 2 1.确认选用的培养菌体是否新鲜，如果菌体需要保存时，请于-80保存 2.起始菌液量过多，导致菌液裂解不充分，部分 DNA 降解。 3.菌体本身富含DNA酶活性，加入Digestion solution后再补加20ul 0.5M EDTA溶液来抑制内源性核酸酶。 Q Q- -3 3 提取的提取的 DN
16、A 中有中有 RNA 污染，为什么？污染，为什么？ A A- -3 3 1.一般提取基因组 DNA过程中，RNA残留已经很少了，如果需要减少提取 DNA 中的 RNA的含量，有必要在消化步骤中加入4l RNase A。 2. RNase A 可能失活。RNase A 一般比较稳定，不易失活。如果确认是 RNase A 长期保存等原因导致其活性丧失，可以用实验室中已有的 RNase A替代试剂盒中的 RNase A。 Q Q- -4 4 提取的基因组提取的基因组 DNA 生物活性差，为什么？生物活性差，为什么？ A A- -4 4 1. 提取的基因组 DNA中盐分浓度过高，请严格按照说明书操作。 2. 提取的基因组 DNA中含有乙醇。离心的速度和时间应该严格遵循说明书要求进行。 Q Q- -5 5 能否用本试剂盒提取酵
