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1、蛋白質轉漬實驗常見問題解答集錦蛋白質轉漬實驗常見問題解答集錦蛋白質轉漬實驗常見問題解答集錦蛋白質轉漬實驗常見問題解答集錦 GEHealthcare 生命科學部逾 20 年來一直為我們的用戶提供高靈敏度、快速和功能應用的 ECL 蛋白質轉漬產品系列。直到今天，世界上第一個化學冷光試劑 ECL仍然被廣泛的應用並獲得用戶的廣泛信賴。在原有的 ECLTM ，ECL PlusTM，ECL AdvanceTM基礎上增加 ECL PlexTM多重螢光系統，進一步拓寬 ECLTM轉漬產品系列，也為大家提供了更多的實驗方案。然而經過繁瑣的 Western Blot 操作之後想要得到一張條帶清晰、沒有雜帶、背景乾
2、淨的圖片還是有一定的挑戰性的。我們經常會遇到沒有條帶、背景過高等問題，沒關係，下面來看看本文的解答。 1，我的檢測結果為什麼無訊號或者訊號很弱? 1) 1) 1) 1)可能原因可能原因可能原因可能原因: : :轉移蛋白失敗或者效率太低轉移蛋白失敗或者效率太低轉移蛋白失敗或者效率太低轉移蛋白失敗或者效率太低 重新檢查轉漬過程：使用染料對膠和膜染色來檢測轉移效果。或者使用 預染的彩虹marker來幫助監控轉印的過程。 優化膠體中的 acrylamide 濃度，轉移時間和電流等來提高轉膜的效率。 確定轉漬過程中膠體和膜正確接觸，膠體和膜的朝向與電極連接正確。 確定在轉漬過程中，是否冷凝效果不好導致高
3、溫產生了氣泡或者膠/膜 變性等情況從而影響了轉印效率。 2) 2) 2) 2)可能原因可能原因可能原因可能原因: : :檢測系統檢測系統檢測系統檢測系統 非常推薦使用 dot blot 系統檢測抗原與一抗的結合效果，並篩選合適的濃度。對於一抗的優化，我們推薦起始濃度可以按照1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000 稀釋，另外注意最優的一抗濃度需要根據所使用的抗體種屬來源的不同而有所改變，除了抗體需要稀釋優化之外，經常值得改變一抗的種屬來源，例如，對於化學冷光檢測 (ECL, ECL Plus and ECL AdvanceTM),抗兔的一抗能產生較強的訊號，但是對於ECL Pl
4、ex，抗鼠的一抗能給予更強的訊號，反之依然。對於ECL Plex CyDye耦聯的二抗我們推薦起始1:1250, 1:1500, 1:2500, 1:3500 和 1:4000 稀釋。通常 1:2500 是 ECL Plex 二抗最理想的稀釋。 確定檢測試劑被正確保存並使用。確定檢測試劑是否有效：在暗室內，預混合小計量的檢測液1和檢測液2（各0.5ml），並加入 1l 的 HRP 標記的抗體，應可觀察到藍光。 低親和力的一抗：使用無 Tween 的溶液。 附上 ECL 相關產品的靈敏度和推薦的一抗，二抗使用量等資訊。 ECL AdvacedECL AdvacedECL AdvacedECL A
5、dvaced ECL PlusECL PlusECL PlusECL Plus ECLECLECLECL ECL PlexECL PlexECL PlexECL Plex 靈敏度靈敏度靈敏度靈敏度(p (p (p (pg g g g 抗原抗原抗原抗原) ) ) 1 pg1 pg1 pg1 pg 5 pg5 pg5 pg5 pg 10 pg10 pg10 pg10 pg 1 pg1 pg1 pg1 pg 一抗使用量一抗使用量一抗使用量一抗使用量 Up to 1/100,000 Up to 1/20,000 Up to 1/5,000 1/100- 1/5,000 二抗使用量二抗使用量二抗使用量二
6、抗使用量 Up to 1/500,000 Up to 1/200,000 Up to 1/15,000 1/1250-1/4000 推薦的膜推薦的膜推薦的膜推薦的膜 Hybond P or Hybond ECL Hybond P or Hybond ECL Hybond ECL Hybond ECL or LFP membrane 推薦應用推薦應用推薦應用推薦應用 最高的靈敏度, 一抗或被檢測蛋白量很少 較高靈敏度 & 用掃描器檢測化學螢光 常規的蛋白轉漬實驗，高靈敏度 重複性，定量精確。多重檢測，最高的靈敏度. 3 3 3 3）可能原因可能原因可能原因可能原因：樣品的上樣量不夠樣品的上樣量不
7、夠樣品的上樣量不夠樣品的上樣量不夠，訊號訊號訊號訊號過低過低過低過低 增加蛋白上樣量，上樣前濃縮樣品 使用靈敏度更高的檢測體系。 延長曝光時間（1-2 小時）。 4) 4) 4) 4)可能原因可能原因可能原因可能原因：蛋白與膜結合較弱蛋白與膜結合較弱蛋白與膜結合較弱蛋白與膜結合較弱 轉印緩衝液中的 SDS（0.05）可以提高轉印效率，但是也會降低蛋白和膜的結合效率，可以降低SDS含量或者不使用SDS。 使用新換的膜以確定正確的水合作用。 2，我的 Western Blot 過程中背景總是很高，怎麼回事？ 1) 1) 1) 1)可能原因可能原因可能原因可能原因: : :抗體濃度過高抗體濃度過高抗
8、體濃度過高抗體濃度過高，訊號訊號訊號訊號太強太強太強太強，膠片超負荷膠片超負荷膠片超負荷膠片超負荷 過高的一抗二抗都會帶來高背景，增加抗體稀釋倍數，採用 dot blot 轉漬技術篩選最合適的抗體濃度。 2 2 2 2）可能原因可能原因可能原因可能原因: : : blocking blocking blocking blocking 不充分不充分不充分不充分 確定 blocking agent 正確製備，並用新配置的 blocking agent。 按需要提高 blocking agent 的濃度（至少到10）和 blocking 時間。 提高 Tween 濃度（提示：Tween 可能降低抗體
9、的結合力，特別對於低親和力的一抗）。 延長 incubation 時間/或者 blocking incubation的溫度。 嘗試替換 blocking agent：1-10BSA TBS-T或者PBS-T（新配）。0.5-3 Gelatin TBS-T or PBS-T(新配)，它們的 incubation 時間和溫度將需要根據不同情況確定，從室溫下1個小時到37或者50過夜均可。 3 3 3 3）可能原因可能原因可能原因可能原因: : :洗滌不充分洗滌不充分洗滌不充分洗滌不充分 增加洗滌次數，時間和洗滌液的量。在清洗時加入少量的表面活性劑如SDS，比 NP-40 的去汙力強，NP-40 比
10、 Tween-20 強。 4 4 4 4）可能原因可能原因可能原因可能原因: : :轉漬器具轉漬器具轉漬器具轉漬器具，緩衝液被污染被污染緩衝液被污染被污染緩衝液被污染被污染緩衝液被污染被污染 清洗或替換所有設備，確定所有緩衝液都是新配和過濾過。 5 5 5 5）可能原因可能原因可能原因可能原因: : :膜的問題膜的問題膜的問題膜的問題 確定膜被全部浸泡在液體中，特別是在洗滌步驟，膜充分水合。 使用新鮮的，高品質的膜：NC 膜建議使用 Hybond ECL。 膜的污染可能導致檢測試劑的非特異性結合，使用手套和非鋸齒型鑷子對轉漬進行小心操作。 洗滌步驟後要使用乾淨的鑷子對轉漬進行操作。 6 6 6
11、 6）可能原因可能原因可能原因可能原因: : :曝光過度曝光過度曝光過度曝光過度 嘗試在在儘量短時間內曝光（至少15秒）。如果不宜再縮短曝光時間，可考慮降低抗體濃度。 再次曝光前，可將轉漬放置盒中5-10分鐘。 3，在使用新產品 ECL Plex 系統的時候需要注意些什麼？ ECL Plex 的主要優勢是採用了兩種螢光染料標記（Cy3,Cy5），從而在 Western Blot實驗中同時完成兩種蛋白的分析，靈敏度更高，定量更精確。在使用 ECL Plex 檢測系統中需要注意: ? 在進行多蛋白檢測時，使用 ECL Plex Cy5 偶聯的二抗來檢測在你樣品中非常低含量的蛋白，因為 ECL Pl
12、ex Cy5 偶聯的二抗較 ECL Plex Cy3 靈敏一些。 ? 在轉膜前，凝膠前端的 Bromophenol Blue 應去除掉，因為在膜上的Bromophenol Blue 也會給出螢光訊號。 ? 為了改善微弱訊號的檢測，跳過 blocking，繼而在轉膜後直接乾燥。室溫下至少乾燥兩小時。也可以通過在操作中用 PBS 0.1% TritonX-100 代替 PBS 0.1%Tween 20 的方法來提高微弱訊號的檢測。 ? 為了減少背景的干擾，使用的 Hybond-ECL 膜可以在掃描前乾燥1小時（37到40）。但 Hybond-ECL 膜在乾燥狀態下很脆弱，我們並不推薦乾燥。 ? 如
13、果你檢測到了很多非特異性的蛋白條帶，我們推薦你使用 Hybond-LFP 膜。使用 2ECL Prime Blocking Reagent 也可減少非特異性的結果。 -更多詳細的原理和操作步驟請參考 GE 產品專家線上講座ECLECLECLECL- - - -Best practice in quantitative Western BlottingBest practice in quantitative Western BlottingBest practice in quantitative Western BlottingBest practice in quantitative We
14、stern Blotting http:/ ECL 檢測中可以選擇哪些 blocking agent? 選擇最佳的 blocking agent 對獲得好的 Western Blot 的結果是非常重要的，最理想的 blocking agent 取決於一抗和二抗以及檢測系統的相容性。在 ECL 檢測系統中，我們推薦使用 ECL Blocking Agent：5% 稀釋在 PBST or TBST (0.1% Tween 20) buffer 中。 我們研究也發現其他的 blocking agent 在 Hybond ECL 和 Hybond-P 膜上使用，ECL 檢測系統也能適用，都能達到相近的靈敏度和信躁比。以下列舉可以使用的Blocking Agent（PBST）： 1. 3% BSA ，30 minutes* 2. 2% Fish Gelatin ，60 minutes 3. 5% Normal Goat Serum ，60 minutes *註:當應用磷酸化蛋白時 BSA 是最優的選擇。 以上是對 Western Blot 實驗中客戶常見的問題進行討論分析，更深入詳細的探討歡迎大家登錄 http:/ 論壇和 GE Lifescience 總部的技術專家進行及時的線上交流。
