米非司酮诱导人宫颈癌hela细胞凋亡机制的研究

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1、【摘要】 目的 探讨米非司酮（MIF）对人宫颈癌 Hela 细胞的凋亡诱导作用及作用 机制。方法 体外培养人宫颈癌 Hela 细胞，流式细胞技术分析不同浓度米非司酮对 Hela 细 胞凋亡率及细胞周期分布的影响，用 Western blot 法检测米非司酮对 Hela 细胞中 NF-B p65 蛋白表达水平的影响。结果 5、10、20 mol/L 的米非司酮均能使 Hela 细胞凋亡率明 显增加，使 S 期、G2/M 期细胞比例减少，G0/G1 期细胞比例显著增加，且作用呈剂量依 赖性；随着米非司酮浓度的增加，Hela 细胞中 NF-B p65 蛋白表达水平逐渐下降。结论 米非司酮可能通过 N

2、F-B 信号通路下调 NF-B p65 蛋白表达，从而调节细胞周期，诱导 Hela 细胞凋亡。 【关键词】 人宫颈癌；Hela 细胞株；米非司酮；凋亡；细胞周期；NF-B；p65Mechanism of cell apoptosis induced by mifepristone in human cervical carcinoma cell line HelaWEI Min, LU Xiaoyuan(Department of Gynecology cell line Hela; mifepristone; apoptosis; cell cycle; NF-B; p65米非司酮(mife

3、pristone,MIF)是人工合成的抗孕激素药物，目前在临床上主要用于终止 早孕、引产等。近年研究发现，米非司酮还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等其他临床新 用途。核因子B (nuclear factor of kappa binding, NF-B)是一种具有多向调节功能的核 转录因子，参与细胞的增殖、凋亡和癌基因的转录调控的信号传递过程，并被证实和宫颈 癌的发生发展密切相关1-2 ，NF-B p65 则是 NF-B 在体内发挥生理功能的主要亚单 位之一。本实验的目的是研究不同浓度的米非司酮对人宫颈癌 Hela 细胞生长及对 NF-B p65 蛋白表达的影响，探讨米非司酮对宫颈癌的治疗作用及

4、其可能的作用机制，为宫颈癌 的防治寻找新途径。1 材料和方法1.1 材料 人宫颈癌 Hela 细胞株（中国医学科学院血液学研究所惠赠） ，米非司酮纯粉剂（浙江 仙琚制药股份有限公司惠赠） ，DMEM 干粉（美国 Gibco 公司） ，碘化丙啶(PI)、MTT（美 国 Amersco 公司） ，NF-B p65 抗体（碧云天生物技术研究所） 。1.2 方法1.2.1 细胞培养 常规复苏冻存的人宫颈癌 Hela 细胞，接种于盛有 DMEM 培养液（含 10%胎牛血清、1105U/L 青霉素、1105U/L 链霉素）的培养瓶中，在 37、5% CO2、饱和湿度培养箱 内培养，隔日更换新培养液一次。平

5、均 34 天传代一次。1.2.2 实验分组 将培养的 Hela 细胞随机分为用药组和对照组。用药组：分为 3 组，分别含有浓度为 5、10、20 mol/L 的米非司酮，各组 DMEM 培养液中乙醇终浓度小于 0.2%，含有 7%胎 牛血清。对照组：培养液中不含米非司酮，只含与用药组相同浓度的乙醇和胎牛血清。1.2.3 实验方法1.2.3.1 流式细胞技术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡率 取对数生长期的 Hela 细胞，制成单细胞悬液，每瓶 4105 个细胞接种于 100 ml 培 养瓶中，培养 24 h 后观察细胞已贴壁，换新培养液，分 4 组（如上所述） ，每组设 3 个样 本，加入含有

6、不同浓度米非司酮的培养液，继续培养 72 h 后，制成单细胞悬液，收集细胞 于流式管中，离心（1 500 r/min、5 min）弃上清，PBS 洗涤 2 遍，沿管壁缓慢加入 70冰 乙醇（4）1 ml，使细胞悬浮固定至少 18 h 后，离心弃上清，PBS 洗涤 2 遍，每管加入 PI 1 ml 染色，4避光 1 h，置流式细胞仪检测分析。1.2.3.2 Western blot 法检测 NF-B p65 的表达 取对数生长期的 Hela 细胞，制成单细胞悬液，以每孔 8105 个细胞接种于 6 孔培养 板中，24 h 后观察细胞已贴壁，分组施加药物干预。分组情况如上所述，每组重复 3 个孔，

7、 继续培养 72 h，收集细胞，按一种新改进的核蛋白的抽提方法3提取核蛋白。将核蛋白 提取液进行蛋白浓度测定后，依次行 SDS-PAGE 电泳、半干转膜、抗原-抗体反应、显色、 拍照。实验过程中，以 -actin 作为内参进行检测，保证实验结果的准确性。最后用 Image J 图像分析软件对条带进行分析，测定其灰度值。1.3 统计学处理 应用 Sigma Stat 2.03 软件进行统计分析，各组数据均以s 表示，采用单因素方差分析， P0.05 表明差异有统计学意义。2 结果2.1 米非司酮对 Hela 细胞增殖周期及凋亡率的影响 与对照组比较，3 个浓度的米非司酮作用 72 h 后，均可使

8、 Hela 细胞凋亡率、G0/G1 期 细胞比例显著增加（P0.01） ，S 期、G2/M 期细胞比例减少(P0.05)，而且随着药物浓度 的增加，其作用逐渐增强，呈剂量依赖性，各用药组间两两比较，差异均具有统计学意义 (P0.05)。见表 1。表 1 米非司酮对 Hela 细胞增殖周期及凋亡率的影响(略)2.2 米非司酮对 Hela 细胞 NF-B p65 表达的影响 Western blot 结果显示，用药组 NF-B p65 蛋白相对表达量均明显低于对照组，差异 均具有统计学意义(P0.01)；随着浓度的增大，米非司酮对 NF-B p65 蛋白表达下调作用 明显增强，且各实验组之间的差异

9、均具有统计学意义(P0.01)。见图 1、表 2。表 2 米非 司酮对 Hela 细胞 NF-B p65 表达的影响(略)3 讨论米非司酮是惟一用于临床的孕激素受体拮抗剂，目前临床上主要用于终止早中期妊娠 等，近年研究证实，米非司酮还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等新用途。目前已有用米 非司酮治疗子宫肌瘤4 、子宫内膜癌5和卵巢癌6的报道，且研究发现，米非司 酮对孕激素受体阳性和孕激素受体阴性的卵巢癌细胞系均具有明显的生长抑制作用7 。 这意味着孕激素受体并不是米非司酮抗肿瘤细胞增殖的必需要素，米非司酮除作为孕激素 受体拮抗剂发挥抗肿瘤作用外，还可以通过其他途径抑制肿瘤的生长。本实验发现不同浓度

10、的米非司酮(5、10、20 mol/L)作用于宫颈癌 Hela 细胞 72 h 后， 均可使 Hela 细胞处于 G0/G1 期的比例增加，使大部分癌细胞不能进入 S 期及 G2/M 期, 减 少了 S 期及 G2/M 期细胞数，并使细胞凋亡率明显增高。这与 Rose 等8研究的米非司 酮对卵巢癌细胞的作用基本一致，说明米非司酮对宫颈癌 Hela 细胞体外生长具有明显的促 凋亡作用，而且米非司酮可能是一种特异性细胞周期抑制药物，通过抑制细胞 DNA 的合 成，使多数肿瘤细胞阻滞在 G0/G1 期，减少其进入 S 期及 G2/M 期，从而抑制肿瘤细胞的 生长。1986 年 NF-B 首先在 B

11、细胞中被发现，是真核细胞的转录因子，在调节细胞凋亡以 及肿瘤生长抑制的信息传递过程中起着重要作用9 。正常情况下，NF-B 在胞质内与抑 制性蛋白（IB、IB、Bcl-3 等）结合，以无活性状态存在于胞质中。但当有刺激因 子如肿瘤坏死因子、放射线、病毒和细菌等作用时，可激活 NF-B 系统，活化的 NF-B 转位进入细胞核，能促进具有细胞保护和抗凋亡作用的基因转录和表达，从而发挥抗 凋亡、促进细胞生长的作用。NF-B p65 是 NF-B 在体内发挥生理功能的亚单位之一， 因此，通过 NF-B 信号通路抑制 NF-B 活化、下调 NF-B p65 的表达，可诱导细胞凋 亡，抑制肿瘤生长。Han

12、 等10研究发现，米非司酮对 NF-B 的调节作用以及 NF-B对细胞凋亡的调节作用具有细胞特异性，并与不同的刺激因素有关。Kalkhoven 等11 研究发现，在孕激素受体阳性的 COS-1 细胞、人类乳腺癌 T47D 细胞，米非司酮能够通过 与孕激素受体结合增强孕激素受体介导的对 NF-B p65 表达的抑制作用。多项研究表明，NF-B 在宫颈癌组织中高表达并与宫颈癌的发生和发展密切相关 12 。本研究采用 Western blot 方法，分析不同浓度的米非司酮对人宫颈癌 Hela 细胞核蛋 白中 NF-B p65 蛋白表达的影响，结果显示，与对照组相比，3 种浓度的米非司酮均能下 调 N

13、F-B p65 蛋白的表达，其作用呈剂量依赖性。综上所述，我们认为，米非司酮对人宫颈癌 Hela 细胞具有调节细胞周期、诱导细胞凋 亡的抗肿瘤作用和抑制 NF-B 的活化、下调 NF-B p65 蛋白表达的功能。据此推测，米 非司酮可能通过 NF-B 信号通路抑制 NF-B 的活化，下调 NF-B p65 蛋白表达，从而 诱导 Hela 细胞凋亡，抑制其生长。而且米非司酮口服耐受性良好，不良反应小，有望成为 临床上治疗宫颈癌的有效药物或提高放疗、化疗敏感性的辅助用药，但是其确切的抗肿瘤 作用机制尚需进一步研究，米非司酮对宫颈癌的确切疗效和适用性尚需通过体内实验（包 括动物实验和临床实验）进一步

14、研究。 【参考文献参考文献】 1 陈春林, 张随学. 在体女性盆腔动脉血管网数字化三维模型构建方法及意义J. 中 国实用妇科与产科杂志. http:/ 2 徐玉静,欧阳振波,刘萍,陈春林. 磁共振成像在子宫肌瘤动脉栓塞术中的应用价值J. 中国实用妇科与产科杂志. 2011(04) 3 方驰华,苏仲和. 数字医学技术在胰腺肿瘤诊断和可切除性评估中的研究J. 实用 医学杂志. http:/ 2010(10) 4 欧阳振波,刘萍,余艳红. 女性骨盆研究进展及意义J. 中国实用妇科与产科杂志. http:/ 5 刘萍,余艳红,陈春林,欧阳振波,宋小磊,王宏琢,昌仁民,王建平. CT 扫描计算机三维 重

15、建女性骨盆的研究方法和应用J. 中国实用妇科与产科杂志. 2010(01) 6 欧阳振波,张随学,刘萍,陈春林,唐雷,李泽宇,黄睿,钟光明,梁波,全显跃,刘畅,钟世镇. 宫颈癌子宫动脉血管网模型的构建及其三维可视化研究J. 中国临床解剖学杂志. 2009(06) 7 吴龙,周义军,高劲松,孙建永,李玉飞,马俊,金科. 女性盆腔的 MRI 三维重建J. 第四 军医大学学报. http:/ 2009(12) 8 张绍祥. 数字化人体与数字医学的研究概况及发展趋势J. 第三军医大学学报. http:/ 9 高成杰, 张随学,裴强,徐达传. 成人盆腔血管多层螺旋 CT 三维重建初步研究J. 中 国临床解剖学杂志. 2006(01) 10 单锦露,张绍祥,刘正津,谭立文,林支付,唐泽圣. 中国数字化可视人女性盆腔的计算 机三维重建J. 解剖学杂志. 2005(03) 11 续靖宁,邓晓红. 子痫前期患者血清游离脂肪酸浓度测定的临床意义J. 右江医学. 2009(02) 12 刘增佑,朱艳宾