生物化学实验指导书 2010

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1、1生物化学生物化学实验指导书实验指导书适用专业：生物科学、食品科学、生物工程、农学、园艺、环境科学适用专业：生物科学、食品科学、生物工程、农学、园艺、环境科学孝感学院生命科学与技术学院孝感学院生命科学与技术学院 2生物化学实验细则生物化学实验细则为了保证生物化学实验的顺利进行， 培养同学们掌握良好、 规范的生物化学基本实验技能， 特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。1. 实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。2. 严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。 3. 进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉

2、戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物嬉耍。 4. 实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。 5. 实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。 6. 使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。 7. 做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。 8. 实验后，要及时完成实验报告。3目目 录录实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色 法 实验二 油脂酸价的测 定 实验三 蛋白质的提取及浓度测

3、定(紫外吸收法) 实验四 淀粉酶活力的测 定 实验五 酶的激活和抑制作 用 实验六 氨基酸的分离鉴定纸层析 法 实验七 基因组 DNA 的快速提取-碘化钾 法 实验八 琼脂糖凝胶电泳技术DNA 样品检 测 4实验九 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 201实验一实验一 还原糖和总糖的测定还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖

4、和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在 540 nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。三、实验材料、主要

5、仪器和试剂1实验材料 小麦面粉(1000 g) 2主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL11 （2） 滤纸 （3）烧杯：100 mL2 （4）三角瓶：100 mL1 （5）容量瓶：100 mL3 （6）刻度吸管：1mL1；2 mL2；10 mL1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度计3 试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 80 烘至恒重的分析纯葡萄糖 100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100 mL，混匀，4冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂23,5二硝基水

6、杨酸（DNS）试剂：称取 6.5 g DNS 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入 1000 mL 容量瓶中，加入 2 mol/L 氢氧化钠溶液 325 mL，再加入 45 g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取 5 g 碘和 10 g 碘化钾，溶于 100 mL 蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取 0.1 g 酚酞，溶于 250 mL 70%乙醇中。（5） 6 M HCl 和 6 M NaOH 各 100 mL。（分别取 59.19 mL 37%浓盐酸和 24 克 NaOH 定容至 100mL） 四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取 7 支 20 mL 具塞刻度

7、试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1 mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/mL 葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值 （OD540nm）0021.50 10.21.81.50.2 20.41.61.50.4 30.61.41.50.6 40.81.21.50.8 51.01.01.51.0 61.20.81.51.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。调分光光度计波长至

8、540 nm，用 0 号管调零点，等后面 710 号管准备好后，测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 葡萄糖标准曲线光密度值32. 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取 3.00 g 食用面粉，放入 100 mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50 mL 蒸馏水，搅匀，置于 50 恒温水浴中保温 20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在 100 mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取准确称取 1.00 g 食用面粉，放入 100 mL 三角瓶中，

9、加 15 mL 蒸馏水及 10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解 30 min, 取出 12 滴置于白瓷板上，加 1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入 1 滴酚酞指示剂，以 6 mol/L NaOH 溶液中和至溶液呈微红色，并定容到 100 mL，过滤取滤液 10 mL 于 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释 1000 倍的总糖水解液，用于总糖测定。（3）显色和比色取 4 支 20 mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，

10、用蒸馏水定容至 20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540 nm，用 0 号管调零点，测出 710 号管的光密度值。表 2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD-540nm）查曲线葡萄糖量（mg）平均值70.5 1.51.5 80.5 1.51.5 9 111.5 10 111.5 五、结果与计算计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、10 管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计)。葡萄糖含量（mg）4提取液总体积查曲线所得葡萄糖

11、毫克数测定时取用体积还原糖（%）= 样品毫克数100 =六、注意1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓 HCl 处理？而在其测定前，又为何要用 NaOH 中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设 0 号管有什么意义？3. 绘制标准曲线的目的是什么？查曲线所得水解后葡萄糖毫克数稀释倍数总糖（%）=样品毫克数0.9100 =5实验二实验二 油脂酸价的测定油脂酸价的测定一、目的与要求初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定

12、油脂酸价的意义。 二、实验原理油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。酸价是指中和 1g 油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。三、主要仪器、实验材料和试剂1. 锥形瓶（250 mL）3 个。2. 量筒（50 mL）1 支。3. 碱式滴定管 1 支。4. 花生油、菜油、芝麻油等。5. 乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)。6. 0.2 KOH（2 克 KOH 溶于 1000

13、mL 纯水中）。四、操作步骤1. 准确称取 12 g 油脂于 250 mL 锥形瓶中。2. 在瓶内加入乙醇乙醚混合液 50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。待油样完全溶解后，加入 1酚酞指示剂 35 滴，立即用 0.2 KOH 标准溶液滴定至溶液成微红色（放置 30 S 内不褪色）为终点，并记录用去的 KOH 的体积，并按下式进行计算。酸价2(V2-V1)/WV2 ：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数V1 ：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数W：油样重(g)注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。6五、实验结果油脂名称起始刻度终点刻度体积 （ mL）酸价备注空白对照六、思考题请对你的实验结果进行分析。7实验三实验三 蛋白质的提取及浓度测定蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法紫外吸收法)一、目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理大部分蛋