《乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术审查指导原则(2015年第32号 附件)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《乙型肝炎病毒基因分型检测试剂技术审查指导原则(2015年第32号 附件)（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 1 附件乙型肝炎病毒基因分型检测试剂 技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）基因分型检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是对乙型肝炎病毒基因分型定性检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知
2、水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、范围我国2006年乙型肝炎流行病学调查表明，我国159岁一般人群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带率为7.18%，5岁以下儿童的HBsAg仅为0.96%。据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例；由于不同的乙型肝炎病毒基因型对现有药物治 2 疗可能存在不同的治疗响应，乙型肝炎病毒分型基因检测在慢性乙型肝炎患者治疗中的作用正被越来越多人所关注。根据HBV全基因序列异质性8的界线，可将其分为不同的基
3、因型。目前，已鉴定的HBV基因型有AI九种，基因型与血清亚型之间的关系已被清晰论证。基因序列的单个核酸的变化即可能改变血清亚型，但血清亚型不能反映基因的差异。通过对HBV全序列分析发现，在不同基因型之间S区段异质性最大，而型内S区段的异质性最小，从而也可以根据S区基因序列异质性4的标准区分不同的基因型。在此基础上，发展了一系列简单、准确的分型方法，推动了HBV基因型的流行病学及临床相关研究。基于现阶段研究，在我国HBV以C型和B型为主。HBV基因型与疾病进展和干扰素治疗效果有关。与C基因型感染者相比，B基因型感染者较早出现乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）
4、血清学转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌；并且HBeAg阳性患者对干扰素治疗的应答率高于C基因型；A基因型患者应答率高于D基因型。其他基因型与疾病谱的关系还未有特殊发现。但是，由于基因型分布不均衡和样本大小的影响，还需要作多中心大样本的研究方能进一步了解基因型与疾病谱之间的关系。 HBV基因型的分布具有明显的地理学特点，大体上如下：A基因型主要流行于美国及北欧国家；B和C基因型主要分布在亚洲及远东地区；D基因型在世界各地均有发现,但主要分布于地中海地区；E基因型仅限于非洲；F基因型则分布在中美 3 洲；G、H、I及J型基因型的地理分布尚不清楚。随着时间的推移，新的基因型可能会被陆
5、续发现。HBV 基因分型检测试剂是指利用包括分子生物学相关方法在内的核酸检测技术，以 HBV 基因序列为检测靶标，对人血清、血浆等样本中的 HBV 不同基因型进行体外定性检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，可作为乙型肝炎感染者临床诊疗的辅助指标之一。 本指导原则适用于基于实时荧光（polymerase chain reaction，PCR）方法的 HBV 基因分型检测试剂，其他方法学的定性检测方法可参照本指导原则，但应根据产品特性确定其中具体内容是否适用，如不适用，应另行选择符合自身方法学特性的技术要求或评价方法。本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜（包括产
6、品风险分析资料等） ，应当符合体外诊断试剂注册管理办法 （国家食品药品监督管理总局令第 5 号） （以下简称办法 ）等相关法规要求。二、注册申报资料要求（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同基因型检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同类产品批准上市，则应详细对该产品的有效性及安全性进行论述，说明理论依据。 4 提交的资料应符合办法和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告 （国家食品药品监督管理总
7、局公告 2014 年第 44 号）的相关要求。（二）主要原材料研究资料应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交工艺验证报告；如主要原材料购自其他供货商，应提供的资料包括：供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。主要包括以下内容：1.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。2.PCR 和组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：2.1 脱氧三磷酸核苷（dNTP）
8、核苷酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和 dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料。2.2 引物由一定数量的碱基构成的特定序列，通常采用（Deoxyribonucleic acid，DNA）合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化。需提供对分子量、纯度、稳定性、功能性实验等的验证资料。如为外购， 5 应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如 PAGE 电泳结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。2.3 探针特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段） ，能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经聚丙
9、烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化，在 5-端(和/或 3-端)进行标记，并经 HPLC 或其他适宜方法纯化，纯度应达到 HPLC 纯。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如 HPLC 分析图谱，应对探针的分子量及标记的荧光素进行核实，并进行功能性试验验证。2.4 酶DNA 聚合酶，应具有 DNA 聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94保温 1 小时后仍保持 50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG） ，具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证。如使用其他工具酶，应提供其详细的研究资料。2.5 核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无 DNase
10、和 RNase污染。2.6 企业内部参考品及试剂内对照（质控品）：由于乙型肝炎病毒不易培养，制备相应的参考品及质控品时，参考品设置建议采用灭活病毒的血清/血浆。并且参考品及质控品与被测临床样本在整个试验过程中应保持相同的检测方式。企业内部参考品以及质控品设置必须客观合理，能够充分 6 评价产品的质量。应采用金标准或其他方法对企业内部参考品以及质控品中物质成分进行确认。2.6.1 阳性参考品及阳性质控品阳性参考品应包含试剂盒所能检测的所有基因型（所有的单基因型以及所有的重组基因型） ，每个基因型应设置不同浓度水平，应能满足验证产品性能的需要，至少设置两个浓度水平（弱阳性、中或强阳性） ；常见基因
11、型（如 B 型、C 型）阳性参考品设置建议采用灭活病毒的血清/血浆。其他基因型阳性参考品设置可采用模拟临床样本。对于阳性参考品的获取方式建议使用金标准的方法或同类方法或者其他能证明问题的方法进行确认。阳性质控品应包含目标靶基因，用于监控整个检测过程，包括：核糖核酸提取，基因扩增和检测。阳性质控品作为单独检测过程，用于模拟患者样本，用于与患者样本进行同时检测。2.6.2 阴性参考品及阴性质控品可采用经确认无目标靶基因的序列的样本。阴性参考品及阴性质控品对照物可反映非特异扩增或检测过程，当不存在目标序列时不会得到相关信号。阴性参考品设置建议采用灭活的血清/血浆。阴性质控品应参与样本核酸的平行提取，
12、对假阳性结果进行质量控制。2.6.3 灵敏度参考品（检测限参考品）灵敏度参考品是评价产品检测能力的重要工具，对于定性产品来说，其设计的合理性显得非常重要。在基因型设置方面， 7 应包括试剂盒所包含的所有基因型。在浓度设置方面，应采用核酸定量的方法对该参考品进行定量检测，明确被测物的具体量值，设置浓度应接近产品最低检出限。2.6.4 精密度参考品 精密度参考品应反映产品检测的重复性以及重复检测的稳定性，该部分参考品应采用临床样本作为精密度参考品，需包括阴性、弱阳性、中或强阳性三个浓度水平的精密度验证。2.6.5 内对照（内标）与目标靶基因平行提取，扩增；用于对检测管内抑制物造成的假阴性结果进行质
13、量控制。内对照（内标）可采用竞争性或非竞争性的引物设置。2.6.6 其他需要注意问题如单个产品检验原理为两种方法学或多种方法学联合检测的方法，应对产品中每种方法学均设置参考品及质控品，用于对不同方法学的质量监控，例如：检测原理为 PCR-杂交方法联用，在这种情况下，不仅需在 PCR 环节设置参考品及质控品对扩增过程进行质量控制；同时在基因探针杂交环节也必须设置质控程序对杂交过程进行质量控制。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料基本生产工艺主要包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对 pH、电导率等关键参数进行有效控制。
14、生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质 8 控方法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。2.反应原理介绍。3.基因位点选择、PCR 方法学特性介绍。4.DNA 提取纯化方法优化，建议包含纯化步骤，内标、质控品均应全程参与提取纯化，不建议采用煮沸法进行 DNA 提取。5.确定最佳 PCR 反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP 浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。6.确定 PCR 各阶段温度、时间及循环数的研究资料。7.对于基线阈值（threshol
15、d）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。8.不同适用机型的反应条件的对比分析，如果有差异应分别详述。如单个产品检验原理为两种方法学或多种方法学联合检测的方法，例如：检测原理为 PCR 方法和基因探针杂交方法联用。应在上述 1 至 8 项基础上完善以下工作：1.主要生产工艺及反应原理介绍。2.杂交膜条的制备工艺。3.确定最佳杂交反应体系的研究资料，包括酶浓度、探针浓度、样本量、加样量及反应体积等。4.确定杂交各阶段温度、时间的研究资料。 9 5.交叉污染和携带污染研究。该类产品适用于检测乙型肝炎病毒感染人群，在临床检测中发现，部分临床样本会出现高浓度的乙型肝炎病毒载量。这部分临床样本在提取过程中
16、增加了交叉污染及携带污染的可能性。在核酸提取过程中，从而导致假阳性的结果。如产品配套采用自动提取设备提取DNA，在携带污染试验中，建议将高浓度阳性（病毒浓度至少不低于108IU/mL）样本与阴性样本在同一待提取反应板中连续交替排列并应进行不少于 5 轮上述提取研究。建议试验使用的高阳性样本水平应接近该产品检测能力的上限。以邻近高阳性样本的阴性样本的阴性结果对比未邻近高阳性样本的阴性结果，评估携带和交叉污染的影响。如产品检测原理中涉及开管检测过程，如自动化膜条杂交仪，应参照该项要求进行验证。（四）分析性能评估资料企业应提交在产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。如有相应的国家参考品，应在分析性能评估阶段采用国家参考品对产品性能进行验证。建议着重对以下分析性能进行研究：1.阳性/阴性参考品符合率所有基因型别的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应 Ct 值的限制；阴性参考品应按要求检出为阴
