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1、浙江工业大学药学院生物化学实验论文2013 年 12 月 13 日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要 是以下内容：（1） ，蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得 初提液 A；b、接着调 PH 并加热、离心得热提取液 B；c、用乙醇沉淀离心得提 取液 C。 （2） ，蔗糖酶的纯化Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯 度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到 提取液 D。 （3） ，蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，
2、第二人测定各提取 液反应后的 OD540值，得各提取液的酶活力与回收率。 （4） ，蔗糖酶蛋白质含量 的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取 液相对应的 OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶 活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以 B 为样品）：先将样品 B 消化 得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用 HCl 滴定馏出液，计算蛋白质含 量。 （6） ，SDS-PAGE 测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固， 再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳， 最后染色和脱色，确定样品相对分子质
3、量。关键词关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯 式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：正文： 文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于 21,2 糖苷键,将蔗 糖水解为 D2 葡萄糖和 D2 果糖 ，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。 蔗糖酶的最适温度为 45-50，最适 ph 为 4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1 实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提 取。
4、酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有 化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎 提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。1.2 试剂与器材 1.2.1 试剂啤酒酵母； 醋酸钠（AR） ； 甲苯（AR） ；4mol/L 醋酸；95%乙醇（B， 可能是因为 C 中蔗糖酶浓度高于 B 或反应时间控制不好； （2） 、蔗糖酶标曲在 01.-0.7 之间呈线性关系，低于 01 或高出 0.7 都要重 新做过；.3.5 注意 做葡萄糖标准曲线时，加完各种试剂后要充分摇匀。要求测得的 OD 值在 0.10.7 测定酶活力时，要准
5、确反应 3min，这个反应时间应该精确把握，不 要多 1 秒也不要少 1 秒 测得在线性范围外的 OD 值，需重新配液显色反应。 由于某些原因我们这一组用的是另一组的试剂，所以数据不符合前面 的实验；3.6 认识与体会（1） 、还原糖的测定方法有菲林试剂热滴法、3,5-二硝基水杨酸法、nelson 试剂法；（2） 、在这种定量且精确地实验中要严格控制一些因素，比如在这个实验中 必须严格控制反应时间；4 蔗糖酶的蛋白质含量测定及比活力计算4.1 实验原理 比活力是指单位质量（mg）蛋白质中酶的含量（U） ，常用来表示酶的纯度。比活力=酶的含量（U）/蛋白质含量（mg） 测定蛋白质含量的方法有福林
6、-酚试剂法、微量凯式定氮法、紫外吸收法、 考马斯亮法等，本实验采用的是福林-酚试剂法，或称 Lowry 法，蛋白质与 Folin-酚 A 试剂（碱性）在碱性条件下形成铜-蛋白质复合物，然后加入 Folin-酚 B（酸性） ，铜-蛋白质复合物将其还原形成深蓝色钼蓝和钨蓝化合物。因为 Folin-酚 B 中的磷钼酸-磷钨酸可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝 色化合物。蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在 750nm 和 660nm 有较强的吸光值。故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的 OD 值，然 后据此测出未知样品的蛋白质浓度5。4.2 试剂与器材mg0.1870.1730
7、.2130.225V总/ml17.119.49.097.8总活力单位数/U9613.626051.648618.401100.25回收率/%10062.9589.6511.444.2.1 试剂 试剂 A（碱性铜试剂） 取 Na2CO3（AR）10g 和 NaOH（AR）2g，加蒸馏水 30ml，微热溶解：另取酒石酸钠 （Na2C2H3O32H2O，AR）0.1g 和 CuSO45H2O（AR）0.05g，再加入 30ml 蒸馏水微热溶解，冷却后将上述两溶 液混合，再用水稀释至 100ml，即为试剂 A。该试剂为含 10% Na2CO3，0.1%酒 石酸钠和 0.05%硫酸铜的 0.5mol/L
8、 NaOH 溶液。保存于塑料试剂瓶中，24至 少可使用 1 个月。溶解于 500 毫升蒸馏水中。 ； 试剂 B（酚试剂） 在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠 （Na2WO42H2O）,25 克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克硫 酸 锂（Li2SO4） ，50 毫升蒸馏水及数滴液 体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍 呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤） 。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试 剂瓶中保存
9、。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约 加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1mol/L 左右。 标准浓度牛血清白蛋白溶液（200g/ml） 精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋 白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。 牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9%NaCl 溶液。 ；4.2.2 器材 分光光度计（使用直径为 10nm 的比色皿） ； 刻度吸管 0.5ml（1） ，2ml（1） ，5ml（1）; 试管 1.5 cm15cm（8） ； 具塞试管 10 ml（3） ；恒温水浴箱（55） ；4.3 操作方法1标准曲线的制作表表 2-62-6 标准
10、曲线的配置加样表标准曲线的配置加样表 管号012345 BSA00.20.40.60.81.0 水4.54.34.13.93.73.5 试剂 A1.01.01.01.01.01.0 静置 10min（立即充分混匀） 试剂 B0.30.30.30.30.30.3 静置 10min（立即充分混匀） 试剂 B0.20.20.20.20.20.2 混匀 55水域 5min,测 A660OD6600.0000.237 0.2160.3440.4810.6230.739由于在振荡时，管 1 有洒出，因此做了两次。 2.未知蛋白浓度的测定 按 A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀释）
11、进行稀释，A 稀释液去 0.4ml，B、C、D 稀释液各取 5ml 测定 OD660(所得数据如上表所 示)。【注意】Folin-酚 B 试剂在酸性条件下稳定，而 Folin-酚 A 试剂在碱 性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当 Folin-酚 B 试剂加入 后，应迅速摇匀（加一管，摇一管） ，使还原反应产生在试剂被破坏之前。4.4 结果与分析 4.4.1 结果表表 2-7 实验结果数据记录表实验结果数据记录表标准牛血清蛋白（ml)标准牛血清蛋白(g)OD6600.2400.216/0.2370.4800.3440.61200.4810.81600.62312000.739样品A
12、1B1C1D1OD6600.3900.2760.3470.118（小）牛牛血血清清蛋蛋白白标标准准曲曲线线图图0 0. .2 21 16 60 0. .3 34 44 40 0. .4 48 81 10 0. .6 62 23 30 0. .7 73 39 9C C1 1, , 7 79 9. .9 96 69 96 69 96 69 97 7, , 0 0. .3 34 47 7B B1 1, , 5 58 8. .4 45 54 45 54 45 54 45 5, , 0 0. .2 27 76 6A A1 1, , 9 93 3, , 0 0. .3 39 9D D1 1, , 1 10
13、 0. .5 57 75 57 75 57 75 58 8, , 0 0. .1 11 18 8y y = = 0 0. .0 00 03 33 3x x + + 0 0. .0 08 83 31 1 R R2 2 = = 0 0. .9 99 99 91 10 00 0. .1 10 0. .2 20 0. .3 30 0. .4 40 0. .5 50 0. .6 60 0. .7 70 0. .8 80 05 50 01 10 00 01 15 50 02 20 00 02 25 50 0蛋蛋白白质质含含量量/ /g gO OD D6 66 60 0值值图图 2-3 表 2-8 实验处理
14、结果总汇表 总体积 /ml总酶活/u总蛋 白/mg比活力 /u/mg蛋白回 收率/%酶活回 收率/%纯化倍 数/倍 初提取 液 A17.09613.62316.2030.401001001.00热提取 液 B18.06051.64210.2428.7866.4962.950.95乙醇提 取液 C8.278618.4016.53521.385.2389.6517.15柱分离 液 D86.341100.250.373014.360.1211.4499.164.4.2 分析 （1） 、此次方法的优点是操作简单，灵敏度高；缺点是蛋白质浓度和光密 度线性关系不够严格，而且不同的蛋白质会因 Tyr 和 T
15、rp 的含量不同， 造成显色程度有差异； （2） 、此实验中由于蔗糖酶不断提纯，虽然也不断损失，但比活力还是应 该上升的，但这次实验中比活力 AB，是因为上次实验我们组的酶活力 没测，这次用的是上次做的那个组的酶活力； （3） 、测 D 的 OD 值时是 0.118，不在线性范围内，但由于 D 试剂不够用， 不重做，本来应该将 D 的取样量提高重做；4.5 注意 试剂 A 加完后，立即充分混匀，静置 10min。再向各管加 B 后放置 10min，再加第二次。 每次加 A、B 后应立即迅速充分混合。4.6 认识与体会（1） 、folin-酚法之所以比双缩尿试剂法灵敏是因为此法显色原理与后者相
16、同，只是加入了第二种试剂-folin-酚 B 试剂，以此增加显色量，从而 提高了灵敏度；（2） 、做实验时要谨慎仔细，尽量避免不必要误差，在本实验中，我在振荡 试管时有时会将溶液振出，虽然量不多，但由于此法灵敏度高也会造成 相当的误差，在振荡方面仍需练习；5 微量凯氏测总蛋白5.1 实验原理凯氏定氮法由 Kieldahl 于 1833 年首创，是一种元素分析方法。根据取样 量分类，可以分为常量和微量。而不同蛋白质中含氮量平均 16%，凯式定氮仪测定含氮量，然后乘以蛋白质 换算系数 6.25，得到蛋白质含量。N / 16% = N 6.25 = 蛋白质含量 实验共需消化、蒸馏、滴定 3 个步骤，其中消化是为了将有机氮转化为无机氮 ，然后在碱性条件下蒸馏，让无机氮转化成氨气出来，用硼酸试剂吸收，最后 用盐酸滴定。滴定指示剂在碱性条件下是绿色，当溶液由绿色-灰色-红色时 可认为是滴定完全。NH2CH2COOH + H2SO4 2 CO2 + 3 SO2
