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1、医学论文医学论文- -再生障碍性贫血小鼠造模方法的实验研究再生障碍性贫血小鼠造模方法的实验研究作者：刘啸，祝彼得，徐 浩，芦殿荣，冯雪梅【 【关关键词键词】 】 ,再生障碍性贫血摘 要: 目的: 改进原有的再生障碍性贫血动物模型的制备方法并进行比较。 方法: 将Balb/c小鼠分为4组，按文献以 60 Co- 射线（Co）、环磷酰胺（CY）、乙酰苯肼（APH）、氯霉素（CH）等不同方法造模获得 3种再生障碍性贫血（AA）模型。检查外周血象、骨髓有核细胞（BMC）数量，细胞 培养比较粒、红、巨核系集落产率。 结果: 3种方法均可导致外周血象降低（P0.01或P0.05），BMC数量减少，细胞集落
2、产 率降低，但改良以后的制法在外周血象协同性下降水平、骨髓抑制持续时间方面 与其他两种有显著性差异。 结论: Co/CY/APH复合造模方法简单，周期较短，结果稳定可靠，可作为一种较好的AA 模型。关键词: 再生障碍性贫血;动物模型; 60 Co-射线;环磷酰胺;乙酰苯肼再生障碍性贫血（Aplastic anemia，AA）是由于 造血干/祖细胞增生，分化障碍或造血微环境异常而导致的一类以造血组织功能 衰竭为特征的疾病。其病因复杂，常与化学药物、放射线、自身免疫性疾病相关。 实验血液学技术的发展，使其致病机理进一步被阐明。而研究的深入有赖于良好 的AA动物模型的建立。目前，AA动物模型的造模方
3、法种类较多，但存在再障期 不稳定、各血系降低水平不一致、方法繁琐、周期较长等缺点。本实验室在综合 几种常见造模方式的优点基础上，建立新的造模方式，并与其他常见的方法作比 较，以期提供一种简单、有效、稳定的模型制备方法。1 材料与方法材料与方法1.1 试剂环磷酰胺（Cyclophosphamide，CY）由上海华联制药有限公司提供，批号:国药准 字H31021703;氯霉素注射液（Chloramphenicol，CH）由天津药业焦作有限公司提 供，批号:国药准字H41020098;乙酰苯肼（Acetylphenylhydrazine，APH）由上海试 剂三厂提供，批号:S32020053。 1.
4、2 动物Balb/c小鼠，68周龄，体重1822g，兼用，清洁级，由成都中医药大学实验 动物中心提供。1.3 方法分组:将60只Balb/c小鼠随机分为正常对照组、CY/Co组、CY/CH组、Co/CY/APH 组4组。造模:第1d，Co/CY/APH组予APH80mg/kg，皮下注射，其余组予生理盐水 等量注射。第2d CY/Co组、Co/CY/APH均予2cGy剂量的 60 Co- 射线照射处理，正常空白组及CY/CH组小鼠假照射（以铅砖屏蔽）。照射后第3d， CY/Co组连续给予 CY50mg/kg共3d，CY/CH组给予CY50mg/kg+CH60mg/kg共3d，Co/CY/APH组
5、于C Y50mg/kg一次性腹腔注射，正常组予生理盐水等量注射3d。检测:各组小鼠在造 模后7d、11d、15d眼内眦静脉采血，自动血球计数仪测定外周血象，断颈处死小 鼠，无菌状态下取小鼠股骨，2mL IMDM培养基冲出骨髓细胞，制备单细胞悬液，吸取100L做骨髓有核细胞（BMC ）计数。以第7d骨髓细胞按本室常规做细胞培养，制备培养体系，接种细胞，置CO 2 培养箱培养，7d后计数CFU-GM、BFU-E、CFU-Me g集落数。1.4 统计实验数据用SPSS11.0软件做t检验。2 结结果果2.1 外周血象的变化表1、2表明，CY/Co组、CY/CH组、Co/CY/APH组造模后外周血 象
6、均有不同程度的下降，第7d检测，3个造模组WBC、PLT均显著下降（P0.01）， 但CY/CH组RBC和Hb下降幅度明显较CY/Co组、Co/CY/APH组小（P0.05），第15 d已基本接近正常组水平。CY/Co组RBC、Hb值较CY/CH组低，但与WBC、PLT下 降幅度相比，仍然维持在一个较高的水平，但模型维持时间较长，至15d检测仍处 于骨髓抑制期。Co/CY/APH组与前两组比较，三系降低均较明显，且RBC、Hb值 下降幅度较CY/Co组更加明显，维持时间与CY/Co组无明显差异。 表1 造模第7天各组外周血象的比较注:与正常对照组比较， * P0.01;与Co/CY/APH组比
7、较， P0.05 表2 造模第15天各组外周血象的比较注:与正常对照组比较， * P0.01;与Co/CY/APH组比较， P0.05 2.2 骨髓有核细胞计数由表3可以看出，第7d、11d、15d处死小鼠后计数骨髓有核细胞（BMC）呈逐渐上 升趋势，提示骨髓抑制随时间延长逐渐恢复。CY/Co组、 CY/CH组、Co/CY/APH组与对照组比较均见数值显著下降（P0.01），但CY/CH组 下降幅度小于Co/CY/APH组及CY/Co组（P0.01），而Co/CY/APH组与CY/Co组未 见显著性差异。 表3 造模第15天各组骨髓有核细胞计数比较注:与对照组比较， * P0.01;与CY/C
8、H组比较， P0.012.3 CFU-GM、BFU-E、CFU-Meg计数 由表4可知:造模后第7d进行造血祖细胞 培养，观察集落产率，3个造模组明显低于正常组（P0.01），CY/Co组及Co/CY/APH组各系产率未见明显差异，但此两组比CY/CH组均明显降低（P0.01）。表4 造模第15d各组CFU-GM、BFU-E、CFU-Meg计算比较注:与对照组比较， * P0.01;与CY/CH组比较， P0.013 讨论讨论再生障碍性贫血造模的药物通常有环磷酰胺、马利兰、苯剂等 1 ，尤以环磷酰胺最为常用。环磷酰胺为烷化剂，可与DNA发生交叉联结，抑制DN A的合成，属细胞周期非特异性药物，
9、其细胞毒性作用强烈，所引发的骨髓抑制 作用迅速，基本可逆。 60 Co- 射线可引起DNA损伤，干扰DNA复制，阻断有丝分裂，抑制细胞增殖。乙酰苯肼 为一缓慢性氧化药物，可导致红细胞膜损伤而减少外周红细胞数量。氯霉素的骨 髓抑制被认为主要作用于造血微环境或造血干细胞。血发生的过程就是造血干/ 祖细胞不断增殖分化的过程，阻断其中任一过程均可导致造血调控的紊乱 2 。单纯采用环磷酰胺造模发现外周血白细胞数量下降显著，而红细胞数量下降缓 慢且不显著，考虑外周成熟红细胞不受环磷酰胺影响，存活周期长，暂时掩盖了 骨髓抑制，且该模型周期较短，对红系的进一步观察带来影响。单纯采用放射线 造模我们发现小鼠造模
10、较环磷酰胺佳，各系下降更为明显，维持周期更长 3 。但剂量不易控制，稍大则小鼠易死，稍低则个别小鼠不易达到抑制效果。我们 在复合造模过程中组合了不同的方式，发现Co/CY/APH法具有迅速降低外周红 细胞数量，周期长而稳定等特点，适合实验血液学的研究。但仍有需专用设备、 专业人员、过程较繁琐等缺点，是否单纯采用药物即可替代放射线处理仍是一个 值得探讨的问题，有待于进一步研究。参考文献参考文献1孙纪元.再生障碍性贫血动物模型实验研究J.中国实验动物学杂志，2000，（4 ）:210-213.2Malerba I，Casati S.Diodovich C Inhibition of CFU-E/B
11、FU-E and CFU-GM colony growth by cyclophos-phamide，5-fluorouracil and taxol:development of a high-throughput in vitro methodJ.Toxicol In Vitro.2004，18（3）:293-300.3Muir KR，Chilvers CE.Harriss C The role of occupational and environmental exposures in the aetiology of acquired severe aplastic anaemia:a case control investigationJ.Br J Haematol.2003，123（5）:906-914.
