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1、 1植物组织培养实验指导植物组织培养实验指导的相关说明的相关说明实验一实验一 实验室基本设备及其用途的识别实验室基本设备及其用途的识别 一、目的 认识植物组织培养实验室的基本结构，必须的基本设备及其用途与作用方法。 二、实验内容 1 实验室的基本结构 （二）化学实验室（工作室）培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理； 培养材料的观察分析；制蒸馏水。 设备、药柜、工作台、蒸馏水器、天平、冰箱，手提高压消毒锅、显微镜、解剖镜、 各种玻璃仪器、金属仪器等。 安装水、电、排气等装置。 （三） 接种室 无菌操作室 接种箱 超净工作台 （四） 培养室 （五） 洗涤、消毒室；卧式高压消毒锅。 （六）
2、温室（培养大棚） 。2实验二实验二 常用仪器、必要器皿、几种主要设备的使用方法、常用仪器、必要器皿、几种主要设备的使用方法、 常用几种药剂的配制常用几种药剂的配制一、目的 认识植物组织培养必需的仪器、器皿，几种主要设备的使用方法、常用几种药剂 的配制。 二、常用仪器 1. 蒸馏水器（学习操作） 2. 手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅（学习使用、操作） 3. 天平 药物天平（工业天平） 、粗天平、 （精密度 1/10） 扭力天平（精密度 1/100） 分析天平（精密度 1/10000） 4. 超净工作台（学习、使用、操作） 5. 电热干燥箱（烘箱） 6. 恒温光照培养箱（学习、操作） 7. 电冰
3、箱 8. 显微镜和解剖镜 手提式解剖镜（学习、使用、操作） 立体解剖镜 普通显微镜 9. 旋转培养机 10. 离心机（学习、使用、操作） 11. 酸度测定仪： 精密 PH47 试纸； 笔型 袖珍酸度计。 三、必要的器皿 （一）玻璃器皿 1. 培养器皿 试管 三角烧瓶（锥形瓶） 圆形高形培养瓶（罐头瓶） 培养皿 扁身培养瓶 L 型和 T 型管 凹面载玻片 2. 盛装器皿 试剂瓶 烧杯 3. 计量器皿 量筒 容量瓶 吸管 4. 其它器皿滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。 （二）金属器械31. 镊子类 2025cm 长型镊子（接种或转移愈伤组织） 尖端弯曲“枪型”镊子（镊取较小的植
4、物组织） 尖头钟表镊子和鸭嘴镊子（剥离表皮用） 尖端为小铲状镊子（挖取带琼脂培养基的培养物） 2. 解剖刀和刀类 眼科用刀种牛痘疫苗的菱形刀（切割柔软组织中小细胞团） 解剖刀（手术刀） 双面刀片焊接在玻棒上（切取茎尖用） 锋利小刀、大刀和小铁锹 3. 剪刀类 解剖剪 眉剪 眼科剪 1825cm 弯头剪 俢枝剪 4.接种针 四、几种常用药剂的配制 （一） 用 95%尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制。 学习配制 70%和 75%酒精。 （二） 消毒剂 1. 20%次氯酸钠溶液 称取 20g 次氯酸钠用少许水溶解，100ml 水定容。 2. 0.1%升汞（HgCl2）溶液 称取 0.1g HgCl2
5、少许水溶解，100ml 水定容。 （三） 洗涤剂 1. 2HCl 酒精 95%酒精 100ml 加入 2mlHCl 2. 硫酸重铬酸钾洗液称取 10g 重铬酸钾加入蒸馏水 90ml，加热溶解冷却后，逐渐加入浓硫酸 175ml，放入棕色玻璃瓶备用， （注意：切记不可将盛过洒精，甲醛等原剂的药品玻璃 器皿直接泡入洗液在，因为重铬酸钾是一种强的氧化剂，一旦被还原氧化，洗液变绿， 失去洗涤作用） 。这些器皿必须用自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液。 （四） 1 摩尔浓度(mg/L )NaOH 和 1 摩尔浓度（mg/L）HCl 配制。 摩尔浓度是指用 1 升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的
6、溶液的浓度。 用 M 表示。 1. NaOH 摩尔浓度（M）NaOH 摩尔质量=分子克数=40g1M NaOH 是指 1000ml 溶液中含有 40 克摩尔质量的 NaOH，现要配制 100ml400.14g 称取 NaOH4g，用少量溶解，定容 100ml. 2. HCl 的摩尔浓度 具体配制酸的 mol 浓度时，应考虑原浓酸的比重 mol 浓度。要求配制的 mol 浓度需配制的体积原酸分子量 V原酸的百分浓度原酸的比重1000配制 1.0M HCl 100ml，量取 38%，比重为 1.19 的 HCl8.06ml 加蒸馏水，定容至4100ml。 实验三实验三 洗涤洗涤灭菌灭菌 植物组织培
7、养能否成功重要的一环是在无菌条件下进行操作与培养，导致污染的来源 主要有： 器皿和用具； 培养基； 培养材料； 工作人员本身； 操作时 的空气。防止污染的有效方法是将所有与培养有关的器皿，用具、培养基、接种室、培养 室等进行灭菌和无菌操作。 一、洗涤 （一）玻璃器皿的洗涤 1. 新购置的玻璃器皿的洗涤（学习、操作） 因有游离碱性物质，使用前先用 1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗， 最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。 2. 已用过玻璃器皿 先将残渣除去；用清水洗净，再用热肥皂水或洗衣粉洗净，清水冲洗干净，最后用蒸 馏水冲洗一次，干后备用。 3. 对一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管
8、及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂 刷洗，自来水冲干净后，晾干，再浸入硫酸重铬酸钾洗液中浸泡若干小时，用夹子取出 在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗 13 遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。 4. 对带有凡士林，石蜡，或胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。 带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去，再用汽油擦洗干净，然后用热肥皂水煮沸半 小时，刷洗后，自来水冲干净。若带有石蜡，可在玻璃器皿下垫几层废纸，放入 6070 温箱中 1 加热2 小时，待石蜡融化后，再用废纸反复擦 23 次即去石蜡再泡入洗衣粉的 热水中洗干净最后用自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净若有胶布粘着物，先用 70%酒精棉球
9、擦 数遍，溶解粘胶物，并用少许去污粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小时，刷洗干净，自来水冲 洗，晾干，再泡入洗液。 (二)金属器皿 新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油，用蘸有四氯化碳（CCl4 ）布擦去油脂，再 用湿布擦净，干燥备用。 二、灭菌 （一）器皿和用具常用灭菌方法： 1. 热压灭菌法（学习操作） 将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1 压力下灭菌 2030 分钟。 2. 干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，15040 分钟或 120两小时，待冷却后使用。 （二）无菌室灭菌（接种室、培养室） 1. 用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。 2. 薰蒸（学
10、习操作） 用甲醛、高锰酸钾提前 13 天薰蒸密封房间方法 1：甲醛倒入蒸发皿加热，用量 10ml/m2。 方法 2：甲醛（HCHO）与高锰酸钾（KMn4）以 10：1 比例混合。 3. 接种前用 7075%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。 4. 用紫外光灯进行照射灭菌（波长 26502660A 最好）接种箱及用具 3040 分钟。（三）培养基灭菌（略）5（四）培养材料灭菌（略） （五）工作人员无菌操作（略）实验四实验四 培养基和培养基成分介绍培养基和培养基成分介绍一、培养基的成分是影响组织培养的最根本的外部因素。 对某种植物培养成功与否是各种条件综合影响的结果。这些综合因素存在于每一个培
11、 养步骤。每一个单因子都可能导致培养的失败。影响培养效果的因素分有外因和内因，外 因有培养基成分及物理状态，培养温度，光照强度，光的质及波长等等。这五种最根本的 是培养基成分，因为它是培养材料的生命之地，它若适宜。培养则易成功，反之则失败。二、培养基的成分（一）大量元素 植物生长必须的 C、H、O、N、P、 K、S、Ca、Mg 九种元素在植物组成中含量较多，通 常占干重或灰分的千分之几，百分之几，所以在培养基中用量较大叫大量元素，大量元素 H、O 两种元素主要从水中获得，C 从光合作用 CO2来，但离体植物或组织没有光合作用能 力。因此通过加糖提供 C 源，常用浓度为 15%，常用分析纯、化学
12、纯的蔗糖。N 常用硝态 N（硝酸钾等）和铵态 N（硫酸铵等）大多数以硝态 N 为主。MS 培养基和 N6 培养基既含有 硝态 N 又含有铵态 N，P 参与植物生命过程中的核酸合成，蛋白质合成，光合作用，呼吸作 用及能量贮存，转化和释放等重要生理生化过程。 K 在近代培养基中，用量有提高的趋势，Ca、Mg、S 的需要则较少。能提供这些元素的 物质主要有磷酸二氢钾（KH2PO4） ，七个结晶水的硫酸镁（MgSO4.7H2O） ，二个结晶水的氯化 钙（CaCl2.2H2O） 。 （二）微量元素 包括 Fe 、Cu、Mo（钼） 、Zn、Na、Mn、Co（钴） 、B（硼）和 I（碘） ，它们在植物组 织
13、培养基中需要量极微，体内含量常在 103105 moi/L 之间，培养基中添加 107105moi/L（摩/升）就可满足需要，多了就会引起植物细胞酶失活，代谢障碍，蛋 白质变性及组织死亡。Fe 是用量较多的一种微量元素，对植物组织叶绿素的合成和延长生 长起重要作用。因使用 Fe (SO4)3（硫酸铁）和 FeCl3（氯化铁）在培养基 PH 为 5.2 以上时 Fe (OH)3沉淀，植物材料无法吸收，故常用 FeSO4.7H2O（硫酸亚铁）和二乙铵四乙酸二钠 （Na2-EDTA）结合成螯合铁成为有机态被吸收和利用。 Cu 有促进离体根生长的作用；Mo 是合成活跃的硝酸还原酶的组成部分，也是固 N
14、 酶的 组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作用；Mg、Zn、Na、是酶的组成部分，也是防止叶绿 素被破坏的作用；Mn 与植物呼吸作用、光合作用有关；B 与糖的运输，蛋白质合成有关， 总之，微量元素在生命活动中，多以酶系中的辅基形成起重要作用。 （三）有机营养61. 维生素类：大多数植物组织或细胞能够合成必要的维生素，但是在数量上显然是 不够的，通常在培养基中补加一种或多种维生素但各标准营养培养基所用维生素组合差别 较大，常使用的有： 维生素 B1（盐酸硫铵素）用量 0.15.0mgL1 维生素 B6（盐酸吡哆醇）用量 0.11.0mgL1 维生素 H（生物素） 用量 0.011.0mgL1 烟酸
15、 用量 0.15.0mgL1 肌醇 用量 100200mgL1 核黄素 用量 0.11.0mgL1 抗坏血酸 用量 1100mgL1 泛酸钙、叶酸 用量 0.52.5mgL1 2. 氨基酸：是重要的有机 N 源，有甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬酰铵，水解酪蛋 白（CH） ，水解乳蛋白（LH） ，它们主要作为营养提供，以利于蛋白质合成，CH 和 LH 是近 二十种氨基酸的混合物，常用量 1001000mgL1 3. 有机添加物 是一些成分较复杂，大多数含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织 的增殖与分化有明显的促进作用，但成分大多不清楚，含量也不稳定，所以一般应尽是避 免使用，特别是新的生长调节剂物质不断产生，更缩小它们的使用范围。 椰乳（CM）：液体胚乳，一般浓度 1020% 香蕉：用量 20200gL1黄熟的小香蕉加入培养基后即变紫色，对 PH 的缓冲作 用影响很大，主要于兰花组培。 马铃薯，去皮去芽后用量 150200gL1，切碎，30 煮分钟，过滤液，加入培养 基，对 PH 有缓冲作用。 其他还有酵母提取液（YE） ，用量约 0.5%；麦芽提取液用量 0.10.5%苹果汁、番 茄汁、柑桔汁等。 （四）琼脂是一种从海藻中提取出来的凝胶性物质，作固体培养基凝固剂用，一般用浓度
