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1、流 式细 胞技术和 流式 细胞仪流式细胞仪首页 第十一章流式细胞技术和流式细胞仪一、荧光染料在流式细胞术中的应用（一）碘化丙啶染色碘化丙啶 (propiolium iodide， PI) 能嵌入 DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20 倍，以 488nm波长激发， DNA/PI 复合物最大的发射波长约为615nm 。1. 小鼠 Lewis 肺癌细胞DNA含量测定方法（1）从 C57BL/6 小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗。（2）去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块。（3）小碎片移入1.2038mm 注射针 , 加压使其通过 , 于 4条件下重悬细胞于HBSS 中。（4）将 200300 L 细
2、胞悬液 (5 105细胞 /mL) 中加入 3mL PI(50 g/mL) ，染色 3LL细胞，于4存放 2030 分钟。（5）测定 580750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI 产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。注： PI 染色液： 0.1%柠檬酸钠1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40水。2. 培养细胞 DNA的流式细胞仪分析（1）从培养皿中吸去培养基，以HBSS 冲洗二次。（2）加入 PI5mL于培养皿中，在4放 10 分钟。（3）用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。3. 完整细胞 DNA 的 PI 染色（1） 70% 乙醇固定
3、的细胞悬液，离心，去固定液。（2）室温条件下加入PI 染色一批细胞 （105 106细胞 /mL） ，时间为 30 分钟， 然后行流式细胞仪分析。（二）吖啶橙染色1. DNA 和 RNA 的鉴别染色利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和 RNA 。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定， 非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和 RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下：（1）试剂：1）溶液 A：低温保存，稳定期约2 周。Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL
4、 8mL 1mol/L NaCL 15ml蒸馏水 76mL ，PH 1.5 （100mL）2）溶液 B ：稳定期数月，最好除菌以后( 高压或过滤 ) 贮存。0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L NaCL 15mL 0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸 18.5mL 蒸馏水 24mL ，总体积为99mL pH6.0 3）吖啶橙母液：用吖啶橙 / 蒸馏水配成1mg/mL(致癌物，应小心) ，吖啶橙应用液0.1mL 母液加 9.9mL 溶液 B稀释。4）注意事项：仪器鞘流系统应保持4。氩激光激发波488nm ，红色荧光为DNA(F600nm),绿色荧光
5、为RNA或单链 DNA(F530nm) （2）方法：1）用含 15% 血清的 PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8 106细胞 /mL) ，加入 0.4mL 溶液 A，4放置 4560 秒。2）加 1.2mL 含吖啶橙的溶液B，室温 2 分钟。3）应在加入溶液B后 10 分钟内进流式细胞仪分析。（3）注意事项： （1）细胞数保持恒定； （ 2）核酸与吖啶橙的比例；（3）染色时间及温度。2. 单链和双链 DNA 的鉴别染色（1）试剂：1）HBSS内含 1000u/mL RNA酶 A，0.2mol/L KCl pH1.35 2）吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7 m),0.2
6、mol/L Na2HPO4缓冲液，pH2.6。（2）方法1）2106细胞悬于 1mL HBSS/RNase液中。2）37温育 1 小时。3） 将 0.2mL 细胞悬液 ( 含 4105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与 0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35) 混匀， 20 30 分钟。4）加 2mL吖啶橙染色2 分钟。5）绿色荧光 (530nm) 和红色荧光 (600nm) 分别代表细胞中单链及双链DNA含量。（三）Hoechst33258 染色以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu) 和 Hoechst33258 染料进行细胞周期分析。1. 试剂：（1）用培养基配制33 mg/L Br
7、du及脱氧细胞苷26.4g/mL 。（2）染色液： Hoechst33258 溶于 PBS ，细胞染色24 小时后进行分析，据报道染色的稳定时间在30 分钟至 24 小时之间。2. 方法：（1）将 Brdu 溶液按 1:10 加入细胞培养液中。（2）根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。（3）孵育后，摇散细胞以传代培养。（4）直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。Hoechst33258 荧光值在410580nm之间，需用330360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤- 胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记DNA ，亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时，在与细胞孵育过程加入Brdu,B
8、rdu 可替代 DNA中的胸腺嘧啶，因此，处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰，此项技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。（四）Hoechst33342 染色Hoechst33342 染色活细胞DNA 1. 试剂： Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L 。2. 方法：（1）制备106/m 细胞悬液，以Hoechst33342 染色，浓度为5 10 mg/L ，室温下20 分钟。（2）分析前切勿洗涤细胞。Hoechst33342 可用作细胞DNA的活体染料，据信可在保持细胞活性的同时，呈现出相当好的DNA化学计量关系， 激发波在紫外
9、范围350 363nm之间，发射波则在450nm处。（五）异硫氰酸荧光素染色以异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyante，FITC）染色蛋白质。1. 试剂： FITC 用含 40 mg/L RNase 的 PBS配成 0.1 1.0 mg/L浓度。2. 方法：(1) 染色前用终浓度70% 乙醇固定细胞，至少18 小时。(2) 离心固定细胞，弃去固定液。(3) 室温下用FIFC 染色细胞蛋白，30 分钟。(4) 流式细胞仪分析，使用氩激光，激发波长488nm ，荧光发射波长515535nm 。也可于固定细胞中，以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制) 和 0.05 mg
10、/L FIFC( 含 40 mg/L RNase ， PBS配制 ) 染色 20 分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色， 分别呈现红色荧光 （DNA ）和绿色荧光（蛋白质） 。（六）若丹明染色若丹明标记单克隆抗体的应用该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞，可用若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞；也可用于测定胞浆中的蛋白质( 如凋亡 BCL-2 蛋白，抗病毒蛋白MXA等) 。1. 说明：用磷酸盐缓冲液Eagles MEM 稀释 FITC 连接的抗体内含0.1%叠氮钠、 2%牛血清。为判定FITC 抗体的最适度的稀释浓度，向微量滴定板的细胞中加入50 L 不同浓度的稀释液，再以荧光显微镜确认最佳染
11、色浓度。使用抗人LEU-I 抗体分析时， 应稀释成 5 mg/L 或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2107浓度时其存活率应在90% 以上。2. 方法：(1) 于微量滴定板加入50L 若丹明标记的抗体，再加入50L 细胞悬液，混匀。(2) 冰浴 45 分钟，离心滴定板（1500r/min 10分钟）。(3) 弃上清，以培养基100 L 洗涤细胞沉淀2 次，每次洗涤后用1500r/min 10 分钟，弃上清。(4) 以 1ml 预冷的培养基配成1106细胞 /mL 的已染色细胞悬液，进样前持续保持冷环境 (4 )。（七）光辉霉素和PI 的双标记 DNA 染色在荧光抗生素光辉霉素和PI 联合
12、染色过程中， 光辉霉素的供体分子被PI 的受体分子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时也适用于体外培养的细胞。1. 分离制备的细胞悬液即可使用，若用70% 乙醇固定可保存一周。2以 PI/ 光辉霉素染色，4 1 小时（ PI 为 10 mg/L 、光辉霉素为10 mg/L ） 。3染色后进样，以100W汞灯作为激光光源，使用BG123nm 阻断滤片，叠加K590型高通滤法。（八） PI 和 FITC 对 DNA 与癌基因探针双标记测定1. 说明：这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物，然后用PI 标记 DNA ，现以研究白血病细胞增
13、殖与癌基因的关系说明操作步骤：2. 方法：（1）制备白血病细胞悬液，用100% 甲醇在 -20固定 10 分钟。(2) 取 50l50 mg/L的癌基因探针Y13-25( 它是一种广谱单克隆抗体，可特异性地直接与N-ras ，Ki-ras和 Ha-ras 三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合 ) ，4作用 3045 分钟。(3) 用 PB离心洗涤2 次，重悬浮于50L HBSS中(含 0.1%叠氮钠和2% 小牛血清 ) 。(4) 加入 50L 1:200兔抗鼠 IgG，4放置 3045 分钟。(5) 同(3) 洗涤后加入50L 1:40的 FITC 标记的羊抗兔IgG，4反应 3045 分钟。(
14、6) 同(3) 洗涤后，细胞用RNA酶消化，室温2030 分钟。(7) 同(3) 洗涤后，用PI 染液染 20 分钟。(8) 同(3) 洗涤后，用488nm激发波长测定。FITC 染色显示ras 癌基因表达产物，PI 染色显示DNA含量。3. 注意事项：（1）制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集；（2）细胞固定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂；（3）为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净；（4）进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。二、记活细胞免疫荧光技术流式细胞仪标本的制备流式细胞仪 (FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算
15、机等 高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、 肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标 志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确 分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM 检 测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下， 活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧 光的结果。 ( 一) 原理 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体 与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧 光强度和阳性百分率即
16、可知相应抗原的密度和分布。 ( 二) 操作步骤 制备活性高的细胞悬液 ( 培养细胞系、 外周血单个核细胞、 胸腺细胞、 脾细胞等均可用于本法 ) 用 10FCS RPMI1640调整细胞浓度为 510107ml 取 40l 细胞悬液加入预先有特异性McAb(5 50l) 的小玻璃管或塑料 离心管，再加 50l 1 20(用 DPBS 稀释)灭活正常兔血清 4 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液2ml 左右 1000rpm 5min 弃上清，加入 50l 工作浓度的羊抗鼠 ( 或兔抗鼠 ) 荧光标记 物，充分振摇 4 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2ml 左右，1000rpm 5min 加适量固定液 ( 如为 FCM 制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧 光显微镜下观察，视细胞浓度加入100500l 固定液 ) FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存57 天)
