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1、吸 收 激 光 发 谱 发 e.g., 射 荧 光 光 谱 E=E 1 -E 2 =hv 第二章 临床生物化学实验室基本技术与管理 实验室的基本技术与管理是临床生物化学检验工作的重要基础。本章所涉及的实验室基本技术与管理主 要是应用于临床生物化学检测的分析技术与质量管理，目的在于加强基础，提高生物化学检验的质量。对于 实验室的其他基本知识，基本技术以及实验室的管理方法，可参阅其他相关教材。 第一节 常用临床生物化学分析技术临床生物化学分析技术很多，常用的主要有光谱分析技术、电泳技术、离心技术、层析技术、电化学分 析技术等。 一、光谱分析技术 利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特
2、征，来确定其性质、结构或含量的技术，称 为光谱分析技术。根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光 谱分析三大类。在临床生物化学检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。 分光光度法(spectrophotometry) I. 光谱分析法(photometry) 1.定义：根据物质吸收、发射或散射辐射能而建立起来的一类分析方法。 2. 光的基本性质：高速传播的电磁辐射； 具有波动性(=c/v)和微粒性(E=hv)； 短波能量大，长波能量小 3. 物质对光吸收的基本原理： 能量转移-当光辐射通过某种物质时，组成该物质的分子与光子发生“碰撞” ，光子的
3、能量就转移至 分子、原子上，使它们由基态(低能态)跃迁到激发态(高能态)，这种跃迁称为激发。 选择吸收-组成物质的分子仅吸收与其内能变化(基态与激发态能量差)相对应的波长或频率的光， 所得到的光谱称为吸收光谱。 能量释放-处于较高能态的分子(激发态分子)不稳定，当其返回基态时，以热或发射光谱的形式将 能量释放出来。所发射出的相应光谱，称分子发射光谱。 激发态(E 1 ) 基态(E 0 )4. 分类 (1) 吸收光谱分析法：根据溶液能吸收由光源发出的某些 波长的光后所形成的特征光谱来鉴定该物质的性质和含量的方法。 (2) 发射 光谱 分析 法：根据物质受到热能或电能等的激发 后所发射出的特征光谱
4、来进行定性及定量分析的一种方法。 (3) 比浊/散射光谱分析法：测定光线通过溶液混悬颗粒后 的光吸收或光散射程度的一类定量方法。比浊法(turbidimetry)：在光源的光路方向上测定透射光强度(透射光 选择性强； 可见、紫外分光光度法(visible and ultraviolet spectrophotometry) * 原子吸收光谱法(atomic absorption spectrophotometry)：微量金属元 素 红外分光光度法 火焰发射光谱法(flame emission photometry)：碱金属/碱土金属元素 荧光光谱法(fluorometry)：少量无机物、酶活力
5、、激素等 精确度和准确度高；仪器设备简单，操作易掌握 3. 吸收光谱 (1) 光谱的产生：化合物分子的价电子跃迁 (2) 吸收光谱曲线：电子跃迁的吸收波长和吸收强度可用仪器测定，在可见、紫外光区内绘制或 扫描得到一条以波长()为横坐标,吸光度(A)为纵坐标的吸收曲线。 4. 光吸收的基本定律(Lamber-Beers Law) (1) 定律：单色光通过吸光溶液后，吸光度与浓度或厚度之间呈正比关系。Lamber 定律：说明吸收与厚度间的关系 Beer 定律：说明吸收与浓度间的关系 (2) 表达式：-lgI t /I o =a bc * I t /I o 为透光率(transmittance, T
6、) (%) A=-lgT= abc *A 为吸光度(aborbance)*a 为吸光系数(absorptivity),即吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。b为液层厚度c 为溶液浓度(concentration) 5. 比色法(colorimetry) (1) 定义：用可见光作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法 (2) 所用仪器：分光光度计(spectrophotometer) (i) 基本原理：溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具 有选择性的。各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，故当某单色光通过溶液时，其能量就会 被吸收而减弱，光能
7、量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系。 (ii) 结构组成(以 722分光光度计为例) 光源：可见光区的光源为钨灯，波长范围是 3201000nm。(紫外光区的光源为氢灯或氘灯，波长是 200320nm)单色器：一种将光源产生的混合光分解为单一波长的光学系统。一般是根据通过棱镜的折射或光栅的衍射 而获得的。 试样室：由比色皿座架及光门组成。可见光区用光学玻璃比色皿(紫外光区用石英比色 皿) 光电管暗盒：由光电管(可将光能转变为可以放大检测和记 录的电能)和微电流放大器组成。 显示器：由放大器和读数元件组成。 (3) 比色法的定量方法： (i)标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操
8、作过程显色后，分别测吸光度(A)，以 A 为纵坐标，浓度为横坐标制标准曲线(至少要 5点)。在相同条件下处理待测物质并测定其吸 光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。 (ii) 对比法：将标准品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。由于测定体系 温度、厚度及入射光波长一致，故标准与待测样品 a反之，吸收峰极值相对应 的波长小于 529nm，则顺时针方向调节螺杆。 2红蛋白及衍生物吸收光谱测定(见书) 分光光度计的使用 1开电源开关，打开箱盖，预热 10mins2将空白管、对照管、测定管分别装入比色皿 (3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁。 3选定波长 4打开箱盖(光路开关自动关闭)
9、，用空白管调T=0 5盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空白管调T=100%(若调不到，则可调节灵敏度开关) 6将选择开关旋至 A,此时显示数值应为 0，否则调节“消光零”旋钮调至 0。 7逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度值 A。 8全部测定结束后，取出比色皿(洗净)，关闭开关。 二、电泳技术 电 泳 Electrophoresis 一、定义电泳带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。 电泳分析技术利用电泳现象进行物质分离的技术。 二、电泳分析技术发展概况 1809 年俄国物理学家 首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压 后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，
10、即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909 年 Michaelis 首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同 pH 的溶液在 U 形管中测定了转 化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937 年瑞典 Uppsala 大学的 Tiselius 对电泳仪器作了改进，创造了 Tiselius 电泳仪，建立了研究蛋白质 的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于 Tiselius 在电泳技 术方面作出的开拓性贡献而获得了 1948 年的诺贝尔化学奖。 1948 年 Wieland 和 Fischer 重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进
11、行过研究。从本世纪 50 年代起，特别是 1950 年 Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种 固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。1959 年 Raymond 和 Weintraub 利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大 地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30 多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和 分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物 质的最高纯度：即“电泳纯” （一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方
12、法，至今仍被人们称 为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check” 。由 80 年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充 分重视。 三、电泳分析技术的分类 1.根据被分离样品的量多少分析电泳制备电泳 2.根据电泳电压的高低常压电泳 0500 V高压电泳 5003000V 3.根据电泳中是否使用支持物自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。区带电泳使用支持物 (1) 按支持物的物理性状不同，可分为 滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 粉末电
13、泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳 (2)按支持物的装置形式不同，可分为 平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳 4.根据电泳系统 pH 是否连续 连续pH 电泳指电泳过程中 pH 保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳 不连续pH 电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的 pH，如 PAGE、IFE优点是在不同 pH 区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目 的。 电泳技术的特点: 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高. 电泳技
14、术应用 基础理论研究; 临床诊断; 工业制造. 双向凝胶电泳和质谱技术的建立和联用,提供了蛋白质组研究所需的技术体系,使得蛋白质组的研究成为可能. 四、电泳的基本原理 一个质点，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、 核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的 pH 值下可以带正电或负电，在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由 于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁
