质量手册_白血病融合基因分型

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1、第 章 质量手册 第 1 页共 1 页 第 A 版第 0 次修订 课题：白血病融合基因分型 颁布日期：2008 年 7 月 31 日 目的：白血病诊断，治疗监测、预后估计和微小残留检测等。 原理： （1）显微镜检查 （2）FISH 试验：荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization FISH）的基本原理是 用已知的标记单恋核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行 特异性结合，形成可倍检测的杂交双链核酸。由于 DNA 分子在染色体是沿着染色体纵轴 呈线性排列，因而可以将探针直接与染色进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与 传统的放射

2、性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可 以多重染色等特点。 3. 仪器与试剂：（1） 相关仪器1）37的水浴箱2）75的水浴箱3）变性热台4）37恒温培养箱5）离心机6）荧光显微镜7）FISH 分析软件8）钻石笔9）微量微液器 （2）相关试剂1）探针（已含 DAPI antifade ）2）20SSC ： 175.3g NaCl + 88.2g 柠檬酸3 ）4SSC：1 ： 5 稀释 20SSC4 ）2SSC：1 ：10 稀释 20SSC 5 ）0.4SSC：1 ：5 稀释 2SSC6 ）0.4SSC/0.3% NP-40 ：0.4SSC 中加入 0.3% NP-

3、407 ）2SSC/0.1% NP-40 ：2SSC 中加入 0.1% NP-408 ）2SSC，0.05% Tween-20 可用 2SSC/0.1% NP-40 代替以上试剂均需将 pH 值调到 7.09 ）固定液要新鲜配制：甲醇/乙酸 3: 110）0.075%KCL 溶液 4. 方法：（1 ）实验前细胞处理1 ）取肝素钠抗凝外周血（骨髓）23ml 放入离心管离心，去除上清液留取细胞沉淀2 ）加入 510 ml 0.075%KCL ，用吸管吹打混匀3 ）放入 37水浴箱中低渗 30 分钟4）取出后加入 1ml 新鲜固定液，吹打混匀，静止 10 分钟后离心5）取出后去除上清液，再加入新鲜固

4、定液 1015ml，吹打混匀，静止 10 分钟后离心6）小心去除上清液，加入 510 ml 固定液吹打混匀后离心7）去除上清液加固定液离心（重复 67 次直到细胞成分洗干净为止）（2）玻片准备1）滴制备好的细胞样本到载玻片上（用显微镜观察细胞分布情况）2）在 2SSC （pH 7.0）液中浸泡 2 分钟3 ）依次在 70% 、85%、100%的乙醇中浸泡 2 分钟，脱水 （3 ）预变性 1）将探针从-20 的冰箱中拿出，留至室温 2）探针溶液用加样枪吸吹使其充分混匀 3）将 10ul 探针液滴到标本玻片上，小心盖上盖玻片，用封片胶完全封片（4 ）变性1 ）将封好的玻片放在 75（+/- 1）的

5、热台上变性 2 分钟（5 ）杂交1 ）将玻片置于避光潮湿（加入湿纱布或海绵）的盒子中，放入 37（+/- 1）培养箱过夜，使其杂交 （6 ）洗片1 ）小心去掉盖玻片和封片胶2 ）在 72（+/- 1 ）的水浴箱中，把玻片浸泡在 0.4SSC/NP-40（pH7.0 ）液中 2 分钟 3）然后在 2SSC，0.05% Tween-20（pH7.0 ）的溶液中浸泡 30 秒 4）晾干，加 10ul 的 DAPI antifade 到玻片上 5）盖上盖玻片，在黑暗的环境中放置 10 分钟 6）用荧光显微镜观察 6. 结果报告由审核者将结果输入 LIS，并核对审核单、标本号及患者姓名，确认无误后，打印

6、 检验报告，并签名发出 7.注意事项：（1 ）新鲜标本取得后，常用肝素钠抗凝。（2 ）新鲜标本取得后，必需三天内完成细胞前处理步骤（3 ）在制备好片后用显微镜观察细胞分布情况，保证细胞分布均匀，尽量没有细胞重叠（4 ）固定液需要新鲜配制（5 ）注明的试剂需将 pH 值调到 7.0（6 ）变性时间应准确控制为 2 分钟临床意义：（1 ）白血病基因诊断（2)微小残留病检测（3 ）供受体性别不同造血干细胞植入检测（4 ）白血病的治疗及疗效观察 拟写人： 张式鸿 批准人： 姜傥 批准日期： 2008 年.7 月 30 日 修改人： 张式鸿 批准人： 姜傥 修改日期：2008-7-30附表：各个相关探针

7、检测的临床意义及诊断标准 序号 探针 临床意义 诊断标准 1 BCR/AB L 双标 融合探 针Ph 染色体为 9 号染色体和 22 号染色体发生 易位融合而成，在 95% 以上慢性粒细胞白血病 （CML）患者，3-5%的儿童急性淋巴细胞白血 病（ALL ）和 25% 成人 ALL 患者 h 会出现， BCR/ABL 是 t（9:22） （q34:q11）染色体易位产 物，监测点该基因对慢性和细胞白血病及 ALL 的诊断，鉴别诊断及预后具有重要意义，在儿童 ALL 中检测到改融合暗示预后较差。BCR 基因标记为绿色，ABL1 标记为红色。阴性细胞呈现两红两绿四个 荧光信号；阳性细胞呈现两个黄

8、色的融合信号。不正常细胞可能 会出现单融合现象。计数 200 个细胞，阳性细胞 比例占 10%左右可报告结果呈阳 性。 2 P53 缺 失探针 位于 17p13 上 P53 缺失，在慢性粒细胞白血病 患者中频繁出现，并且是慢性粒细胞白血病中排 在第二位的染色体异常。在 10% 的病例单独出 现或者伴随另外的染色体异常，p53 缺失与慢性 粒细胞白血病高比率的急性变为急性非淋巴细胞 白血病（ANLL）相关。在 7-8%的 CLL 病例中， 可发现 P53 缺失，P53 缺失相对于其他染色体异 常如 11q 缺失，12q 三体，13q 缺失，在无治疗 间期疾病进展最快，生存率最差。另外 P53 缺

9、 失也是对化疗耐药的一个分子标记。 P53 探针标记为红色，探针还包含 17 号着丝粒质控探针，标记为绿 色。 阴性细胞呈现两红两绿四个荧光 信号；阳性细胞缺失一个或两个 红色信号。阴性或阳性细胞都会 出现两个绿色荧光信号。 计数 200 个细胞，阳性细胞比例 占 10%左右可报告结果呈阳性。 3 CHIC2 缺失探 针 CHIC2 位点位于 4q12，该位点在 FIP1L1 基因和 PDGFRa 基因发生融合时出现缺失，而 FIP1L1 基因和 PDGFRa 基因融合会产生一个新的酪氨 酸激酶，这个酪氨酸激酶是格列卫（Gleeve)药 物的治疗靶点，因此 CHIC2 缺失的检测可以预 测格列

10、卫治疗反应。 CHIC2 位点标记为红色，探针还 包含 4 号端粒质控探针，标记为 绿色。 阴性细胞呈现两红两绿四个荧光 信号；阳性细胞缺失一个或两个 红色信号。阴性或阳性细胞都会 出现两个绿色荧光信号。 计数 200 个细胞，阳性细胞比例占 10%左右可报告结果呈阳性。 4 AML1- ETO 双融 合探针 AML1-ETO 探针检测的是染色体 t(s：21） （q22；q22)易位，此种易位最常出现在急 性粒细胞白血病（啊、AML ）M2 患者， 少见于 M1 或者 M4 型，在 AML 中发生率 为 10%，占 M2 型 AML 的 40% ，最常出 现在儿童 AML 患者。 ETO 基

11、因标记为绿色，AML1 标记为 红色。 阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号； 阳性细胞呈现两个黄色的融合信号。 计数 200 个细胞，阳性细胞比例占 10%左右可报告结果呈阳性。 5 PML- RARa 双融 合探针 PML-RARa 探针检测的是染色体 t（15:17 ） （q22:q21)易位，最常出现在 AML, M3 型 患者，M3 型在成人 AML 患者中发病率为 10%。检测到 PML-RARa 易位融合基因的 早期死亡率为 15-20%，联合维甲酸化疗可 以显著延长生存时间。 RARa 基因标记为绿色，PML 标记为 红色。 阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号； 阳性细胞呈现两个黄色

12、的融合信号。 计数 200 个细胞，阳性细胞比例占 10%左右可报告结果呈阳性。 6 ATM 缺失 探针 FISH 技术在 11-18%的慢性淋巴细胞白血 病（CLL）病例中可以检测到 11q22-q23 缺失，ATM 基因位于该缺失区域，ATM 基因缺失的检测标志着淋巴结病和预后较 差。 ATM 探针标记为红色，探针还包含 11 号 着丝粒质控探针，标记为绿色。 阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号。 阳性细胞缺失一个或两个红色信号。 阴性或阳性细胞都会出现两个绿色荧 光信号。 计数 200 个细胞，阳性细胞比例占 10%左右可报告结果呈阳性。 7 CBF/MY H11 双融 合探针 融合基因

13、CBF/MYH11 由 inv(16) (p13q22)倒位产生，可见于 20% AML M4 型患者，特别是嗜红细胞增多症患者，罕 见于无嗜红细胞增多症得 M2 ，M5 和 M4 型患者。总体在 5-10% AML 中可见 16q22 异常。此型染色体异常具有较高的 MYH11 基因标记为绿色，CBF 标记 为红色。 阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号； 阳性细胞呈现两个黄色融合信号。 计数 200 个细胞，阳性细胞比例占 10%左右可报告结果呈阳性。完全缓解率，预后比大多数涉及染色体异 常的 AML 患者要好。 8 MYH11 新裂点探 针MYH11 探针针对 Inv(16)(p13q22)

14、和 t(16,16)(p13,q22),在 10%新发生的 AML 患者可见， 最常见于 M4 型，约占 20% 患者，治疗有很高的 完全缓解率，在新发的成人 AML 中作为很好的预 后因子，比大多数的其他 ANLL 预后更好，中位 生存时间为 5 年。阴性细胞呈现两个黄色融合信号； 阳性细胞呈现两红两绿四个荧光信号， 或有一个黄色融合信号。计数 200 个细胞，阳性细胞比例 占 10%左右可报告结果呈阳性。 9 MYC 断 裂点探针MYC 原癌基因的易位分别会导致 MYC 在 t（8；14） ，t(8；22）和 t （2；8) 与 IgH ，IgL 和 IgK 融合，主要发生在 B 细胞 A

15、LL 核非霍杰金 白血病(NHL ） ，特别是 Burkitt 淋巴瘤。t(8 ；14） 易位存在于 75-85%患者，t(2；8）易位存在于 5% 患者，剩下的 10%患者为 t(8 ；22）易位。MYC 易位重排的患者预后差，但这些易位对强力化疗 反应好，可增加患者生存率。阴性细胞呈现两个黄色融合信号； 阳性细胞呈现两红两绿四个荧光信号， 或有一个黄色融合信号。计数 200 个细胞，阳性细胞比例 占 10%左右可报告结果呈阳性。 10 TEL/AML 1 双融合 探针TEL/AML1 探针检测染色体 t(12 ；21） （p12;q22）易位，在 15-35%的儿童 B 细胞 ALL 中可

16、见，也是该型白血病中最常见的易位。在成 人和幼儿很罕见，主要为儿童，男性和女性同等 发生率，检测到 TEL/AML1 预示预后良好。AML1 基因标记为绿色，ETV6 标记为红色。阴性细胞呈现两红两绿四个荧光 信号；阳性细胞呈现两个黄色的融合 信号。计数 200 个细胞，阳性细胞比例 占 10%左右可报告结果呈阳性。 11 13q14.3 缺失探针染色体 13q 缺失可在多种血液性肿瘤发现， 包括 B 细胞 CLL，NHL 和多发性骨髓瘤等。在 ALL 中，大约 2% 的成人和儿童可检测到 13q 染色 体缺失，在 13q 缺失的 ALL 患者中有更高一些的13q14.3 基因标记为红色，13 号染 色体端粒标记为绿色。阴性细胞呈现两红两绿四个荧光 信号；阳性细胞 11 缺失一个或两个红