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1、白色念珠菌侵染内皮细胞引发炎症反应的机制摘要：内皮细胞可以通过宿主炎症反应对抵制血液传播微生物病原菌产生重要的影响。之前，我们发现内皮细胞对体外侵染白色念珠菌通过分泌白细胞介素8（IL-8） ，表达选择蛋白、细胞间附生分子 1（ICAM-1） 、血管附生分子1（VCAM-1） 。我们确定白色念珠菌刺激内皮细胞合成瘤坏疽因子 a（TNF-a） ，他能通过自分泌机制依次诱导那些侵染细胞分泌 IL-8 和表达选择蛋白。VCAM-1 的表达不仅受到 TNF-a 的调节，还有 IL-1a 和 IL-1B 的作用，所有这些内皮细胞合成的物质都是对白色念珠菌的回应。这三类细胞活素保持主要的细胞关联而不是被隐
2、藏。ICAM-1 表达的白色念珠球菌的感应与 TNF-a 、IL-1a和 IL-1B 是独立的这些都证明了内皮细胞对白色念珠菌的不同的炎症反应是通过截然不同的机制导致的。对这些机制的一个很重要的的认知就是内皮细胞对白色念珠菌反应的治疗缓解或是对其他引起造血传播的机会致病菌的治疗。白色念珠菌是一种造血传播的条件致病菌，能在病人体内导致严重的侵染。大多数的有这种病原菌侵染危险的病人包括嗜中性白血球减少症的癌症患者，出生重量较低的婴儿，以及那些近期做过腹内手术或静脉导管的个人。内在的中心静脉导管的作用和光谱抗生素的治疗是这种病原菌侵染额外的危险因素。随着医药技术发展的结果，造血传播的念珠菌病危险的人
3、近几年增长很快，念珠菌属是现在从临床病人血液中分离的第四种常见的有机体。尽管抗真菌治疗不断发展，造血传播的念珠菌病的必死性仍约为 38%。因为这种不能接受的高的致死率，预防和治疗这种侵染的新的方法需要加快发展。一种潜在的策略是能够提高宿主对这种侵入软组织之前，处在血管间隔时能发生血液传染的病原菌的炎症反应。据此，我们观察了白色念珠菌对内皮细胞侵入的体外实验。根据别人及我们自己的研究，导致造血性传播的白色念珠菌侵染的模型得到了发展。首先进入了血液的有机体黏附在脉管系统的内皮细胞的细胞衬里。内皮细胞和白色念珠菌的这种直接接触特别可能发生在中性粒细胞减少或中性粒细胞功能不全患者。依附的有机体然后通过
4、导致他们自己的吞噬作用击穿内皮细胞。吞噬作用的诱导要求完整的内皮细胞的细胞微丝和微管，它不要求有机体血清组分的调理作用。一旦在内皮细胞的细胞里面，有机体有可能伤害和最终杀害这些细胞和从而获得的深组织。内皮细胞损伤也可能导致内皮下的细胞矩阵的暴露，可以绑定其他生物。我们发现血管内皮细胞不是被动的在这处理，而是通过白细胞黏附分子的表达积极回应念珠菌的入侵，例如，细胞间粘附表示的白细胞粘附分子分子 1 (ICAM-1) ,E-选择蛋白和血管细胞黏附分子 1 (VCAM-1)。 对白色念珠菌的回应，内皮细胞还分泌白细胞介素 6(IL-6), IL-8、 单核细胞趋化蛋白 1 与前列腺素。这些炎性介质可
5、能提高活性血管入侵白细胞的补充，他们能够帮助宿主防御。如果存在足够数量的功能白细胞，入侵的有机体可以被杀死和感染可以被中止。因为内皮细胞对白色念珠菌的回应可能是对有机体炎症反应的数量和组成的测定很重要，我们检测白色念珠菌刺激内皮细胞分泌 IL-8 和 ICAM-1,E-选择蛋白与 VCAM-1 表达。我们当前的结果表明这个有机体通过不相连的机制刺激各个不同的炎症调节子的合成。调解这些响应的机制是不同的那些调解其他微生物对血管内皮细胞的反应病原体如巨细胞病毒、 立克次氏体。这种信号转导机制的多样性可能提供内皮细胞的细胞以重要能力根据传染的有机体选择性地调整激动的反应。材料和方法有机体：白色念珠菌
6、 ATCC36082,一个临床分离菌株,是从美国文化收集库获得.一个萌发缺陷型白色念珠菌菌株 V6 ,由 Helen Buckley 提供。所有的有机体都生长在 25的酵母氮基础鱼汤另外还加有 0.5%（质量/体积）的葡萄糖的培养基中摇床过夜培养。通过离心收集芽生孢子并用磷酸盐缓冲液冲洗两遍.冲洗得到的生物体用计数板计数。白色念珠菌 36082 的 3106个/ml 芽生孢子接种到 RPMI1640 培养基置于37的摇床上孵化 90min 用于准备被杀死的、发芽的生物。超过 90%的生物体在这种条件都会产生萌发管。萌发的生物体之后暴露于室温条件下 20mM 的高碘酸钠溶液 30min 以杀死生
7、物体。用之前加入到内皮细胞的磷酸缓冲液冲洗。部分的生物体注射葡萄糖以证明所有的生物体都已被杀死。我们之前的结论表明用这种方法杀死的白色念珠菌细胞被内皮细胞所吞噬。内皮细胞：通过 Jaffe 等的方法用胶原酶收获人类脐静脉内皮细胞。他们用 M-199 补充 10%的牛胎儿血清，10%的旧的牛血清以及 2Mm 的有青霉素合链霉素的谷氨酸盐的培养基培养组织生长。细胞生长在多井的组织培养皿中，上面涂上一层纤维连接蛋白。所有的实验都采用紧紧汇合三分之一的内皮细胞。根据计数板计数，大约有 5104 个/cm 2 内皮细胞在汇合的培养基表面。所有组织的内毒素浓度和真菌培养基用鲎溶解物试验测定。在所有培养基中
8、内毒素的浓度都低于 0.1IU/ml。另外，内皮细胞样品中单核细胞/ 巨噬细胞的存在用非特异性酯酶染色测定。准备所有的内皮细胞包括低于 0.1%的这些细胞。内皮细胞刺激：实验那天，内皮细胞上面的组织培养基吸出，并用新鲜的含有白色念珠菌的培养基重新加入。在所有的实验中，白色念珠菌与内皮细胞的比例接近 1:1.5。所有的生长均是在含 5%的 CO237条件下孵化 8h。每组实验至少重复 3 次，用不同脐带上的内皮细胞。为了确定到底是 IL-1 还是 TNF-a 是白色念珠菌刺激内皮细胞表达白细胞粘附分子或分泌 IL-8,IL-1ra 所必需的和用于对准 TNF-a，IL-1a，或 IL-1B 的中
9、和鼠单克隆抗体。用重组的细胞活素到指定的抑制剂中的滴定实验确定每种抑制剂的浓度。每一种抑制剂所用浓度要求能够对内皮细胞刺激产生大于 95%的抑制力，通过 E-选择蛋白和 IL-8 分泌来确定。IL-1ra 的最终浓度是300ug/ml,Mabs 是 2.5ug/ml。在 MAbs 的实验中同样浓度的 IgG1 加入到内皮细胞的控制井。所有的抑制剂在色质之前直接加入内皮细胞和出现在培养基内持续实验的进行。因为血小板活性因子（PAF）已经有报道能够调节内皮细胞在对一些色质发生反应时 ICAM-1 的表达，PAF 受体拮抗剂 WEB2086 检测它抑制念珠菌 ICAM-1表达的能力。我们发现仅 PA
10、F 不能引发内皮细胞的刺激。因此，WEB2086 的最佳浓度由它抑制 10umPAF 感应的血小球聚集的能力所决定。血小板聚集的程度用 Yeaman 等人的方法用血小板凝集计测定。WEB2086 的浓度为 50um 是发现可以完全抑制 PAF 诱导的血小板聚集。因此，这个浓度可以用于内皮细胞实验。在所有的用 WEB2086 的实验，内皮细胞的对照组血小板暴露在相同的稀释浓度下（0.1%二甲基亚砜） 。条件培养基的准备：为了得到适宜内皮细胞和或白色念珠菌生长的培养基，采用含有 6ml 的组织培养基的 25cm2组织培养瓶。培养瓶中，有或者没有内皮细胞的存在，接种上 1.67106的白色念珠菌。接
11、种后 8h，收集条件培养基，冰上冷却，之后 500g 离心 7min，收集上清液，储存在-70下备用。RT-PCR:内皮细胞细胞素和白细胞粘附分子 mRNA 表达用 RT-PCR 检测。内皮细胞在 24 井组织培养皿中暴露于白色念珠菌或 500ul 条件培养基中 8h。在培养基被吸出和细胞被冷的平衡盐溶液冲洗掉后，总的内皮细胞 RNA 用异硫氰酸盐提取。在之前的实验中，我们已经测定用这种方法只从内皮细胞而不是白色念珠菌中提取的 RNA。所有的反转录和 PCR 都在同样的离心管中，用 10-200ng总的内皮细胞 RNA。用于扩增目的 mRNA 的引物列在表 2.PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分离
12、，用溴化已錠显色，光密度法定量。为保证每个条件的等量的 RNA 被扩增，对结果规范 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的结构基因表达(表 2)。在之前的实验，每一组引物的反应条件进行优化，以便 RNA 输入的量和 PCR 产物呈线性关系。白细胞粘附分子表达和细胞活素合成的测量：生长在 96 井组织培养皿中内皮细胞的 E-选择蛋白，ICAM-1 和 VCAM-1 的表面表达由 Noel 等人 ELISA 方法进行测定。ELISAs 实验中所用的 Mabs 见表 1。试验中监测内皮细胞分泌 IL-8,细胞生长在 48 井的组织培养皿中。细胞用白色念珠菌刺激之后，收集培养基，4下 500g 离心 5
13、min，去除细胞核杂质，储存在-70下。之后，用 ELISA 检测培养基中 IL-8 的浓度。关于白色念珠菌在分泌数量上的影响和内皮细胞相关的 IL-1a，IL-1B 和 TNF-a 采用内皮细胞生长在 6的组织培养皿上测定。随后暴露于白色念珠菌收集培养基并按照上述的 IL-8 实验进行。内皮细胞之后用冰的平衡盐溶液冲洗并溶解在含有 100 mM Igepal CA-630，10 mM NaN3, 和 10 mM 苯基氟化物的 PBS 溶液中。培养基中不同细胞活素类的浓度和溶解产物用ELISA 测定。内皮细胞损伤的衡量：在各种不同抑制剂存在的由白色念珠菌引起的内皮细胞损伤的程度采用之前所述的铬
14、释放化验测定。孵化时间，抑制剂的浓度，有机体与内皮细胞的比例都与内皮细胞刺激实验相同。数据分析：内皮细胞对不同条件的反应采用多重比较的方差分析来评估。P 值0.05 认为是有意义的。结果受白色念珠菌感染的内皮细胞的条件培养基对未感染的内皮细胞的影响：首先，我们观察是否是白色念珠菌刺激内皮细胞分泌 IL-8 和通过溶解因子表达白细胞粘附分子. 这些被选为研究的免疫调节剂，因为它们可能在白色念珠菌侵染人造成造血传播的地方有助于混合化脓性肉芽肿反应。用白色念珠菌侵染内皮细胞 8h。在孵化过程中，白色念珠菌的芽生孢子萌发并且菌丝侵入到内皮细胞当中。在孵化期结束时，收集并保藏以上侵染内皮细胞的条件培养基
15、。之后加入到未侵染的内皮细胞 8h。我们发现那些侵染的内皮细胞能够生长的条件培养基，野生型的白色念珠菌刺激未侵染的内皮细胞分泌 IL-8。这种条件培养基对刺激未侵染的内皮细胞表达 ICAM-1，VCAM-1 或 E-选择蛋白没有重要作用。这种条件培养基只能刺激IL-8 分泌当它暴露于活着的，萌发的白色念珠菌的内皮细胞中获得时。内皮细胞暴露于活着的或是杀死的白则念珠菌的条件培养基，突变体 V6 都不是刺激因子。这些发现组成了我们之前的观察：直接接触杀死的有机体和突变体不能刺激内皮细胞积累 IL-8 的 mRNA 。当白色念珠菌细胞生长在内皮细胞存在的单独塑料板上时，它们的生长和萌发与那些生长在内
16、皮细胞的有机体相同，不过，当它被添加到未受感染的内皮细胞这些生物体制约诱导 IL-8 分泌的条件培养基。这些发现表明内皮细胞在条件培养基中是大多数刺激因子可能的根源。然而，我们不能完全排除一种可能就是在内皮细胞存在的白色念珠菌的生长诱导有机体释放那些对未侵染的内皮细胞刺激有贡献的物质。我们也用 RT-PCR 技术分析了内皮细胞反应，为检测条件培养基对 mRNA 积累的影响。结合以上的这些结果，我们发现内皮细胞暴露于活着的萌发的白色念珠菌的条件培养基刺激 IL-8 mRNA 的积累。然而，这种培养基也可以诱导 ICAM-1 和 VCAM-1 的 mRNA 积累，而不是E-选择蛋白。这些发现表明白色念珠菌的这些白细胞粘附分子表达的刺激的机制可能是不需要溶解因子或者需要一种额外的组成成分。内皮细胞在对白色念珠菌反应时合成 IL-1a，IL-1b 和 TNF-a：条件培养基实验表明了内皮细胞对白色念珠菌的反应的刺激极有可能以一种间接或反馈的机制发生。因此，我们观察内皮细胞是否色念珠菌侵染的反应合成 IL-1a，IL-1B
