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1、限制性核酸内切酶,制作人：* 日 期：*,简介,限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。别名 Endodeoxyribonuclease酶反应 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。,单位定义 在指明pH与37，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1g的DNA的酶量为1单位。,定义和命名,DNA限制性内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样
2、可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。,特征和种类,1限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host control
3、led specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。E.coli 菌株 噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗
4、传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。,2.限制与修饰系统的种类根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 型（type ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-
5、6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。s 型（type s）限制与修饰系统，占 5% ，与 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。在 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中
6、的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。, 型（type ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。如 EcoK 和 EcoB。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。EcoK 编码基因的结构为 R2M2S。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2
7、。EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。 TGA*（N）8TGCT EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。 AAC（N）6GTGC但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。 型（type ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp
8、 处。在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 型系统中的种类。,表2-1：各种限制与修饰系统的比较,限制酶识别的序列,1限制酶识别序列的长度限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2-2）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。 4 个碱基识别位点：Sau3A GATC5 个碱基识别位点：EcoR CCWGG；Nci CCSGG6 个碱基识别位点：EcoR GAATTC； Hind
9、 AAGCTT7 个碱基识别位点：BbvC CCTCAGC； PpuM RGGWCCY8 个碱基识别位点：Not GCGGCCGC Sfi GGCCNNNNNGGCC以上序列中部 分字母代表的碱基如下。R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 CK=G 或 T S=C 或 G W=A 或 TH=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T,2限制酶识别序列的结构限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoR 和 Hind 的识别序列和切割位置如下： EcoR GAATTC；
10、Hind AAGCTT CTTAAG TTCGAA有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSCCGCTC（-3/-3） 和 BssSCTCGTG（-5/-1）。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。AccBS CCGCTC；BssS CTCGTG GGCGAG GAGCAC有一些限制酶可识别多种序列，如 Acc 识别的序列是 GTMKAC ，也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 Hind 识别的序列是 GTYRAC 。有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwN 和 Dde ，它们的识别序列如下：AlwN CAGN
11、NNCTG；Dde CTNAG GTCNNNGAC GANTC,3限制酶切割的位置限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3A（GATC）、Nla（CATG）和 EcoR（CCWGG） 等；在两侧的有 Bcg（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）和 TspR（CASTGNN）， Bcg 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvGCAGC（8/12） 和 BspMACCTGC（4/8） 等。Bcg 10（N）CGA（N）6TGC（N）1
12、2； 12（N）CGA（N）6ACG（N）10 TspR NNCAC（G）TGNN NNGTG（C）ACNN,1限制酶产生匹配粘端（Matched end）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5 侧切割底物，DNA 双链交错断开产生 5 突出粘性末端，如 EcoR ；若在 3 侧切割，则产生 3 突出粘性末端，如 Kpn 。 EcoR NNGAATTCNN NNCTTAAGNN2限制酶产生平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端
13、，如 Hae（GGCC），Sma（CCCGGG），EcoRV（GATATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。,限制酶产生的末端,3限制酶产生非对称突出端许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvC，它的识别切割位点如下：CCTCAGCGGAGTCG有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 Acc，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称：GTAT/CGACCATA/GCTG有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 Dra 和 Ear，它们的
14、识别切割位点分别是 CACNNNGTG 和 CTCTTC （1/4）。,4同裂酶（isoschizomer） 识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为以下几种情况。 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同，如 Hind 与 Hinc 识别切割位点为 GTYRAC ， Hpa 与 Hap 识别切割位点为 CCGG ， Mob 与 Sau3A 识别切割位点为 GATC 。 同序异切酶 Kpn 和 Acc65 识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为 GGTACC 和 GGTACC 。另外， Asp718 识别和切割位点为 GGTACC 。 “同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoR 识别和切割位点为 GAATTC ， Apo 识别和切割位点为 RAATTY ，后者可识别前者的序列。另外， Hpa 和 Hinc 的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为 GTTAAC 和 Hinc 。 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 Sal 位点（识别切割位点为 GTCGAC），该位点也可被 Acc（识别切割位点为 GTMKAC）和 Hinc（识别切割位点为 GTYRAC）切割。,
