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1、植物生产新型生物聚合物 PHB 的研究进展 王彩芸 郑振坤 青岛科技大学化工学院 摘 要： 聚-羟基丁酸酯 (polyhydroxybutyrate, PHB) 是一种可完全生物降解和具有良好生物相容性的高分子材料, 可作为传统塑料的替代品, 在塑料、化学药品和饲料市场上具有巨大的商业应用价值。近年来, 用植物生产新型生物聚合物 PHB 的技术取得一定进展, 可望通过农业生产提供可再生的工业原料, 这使得它具有广泛的发展前景。采用转基因方法可以大幅度提高用植物生产 PHB 的产量, 包括控制启动子来驱使转基因表达, 减少内源性酶在竞争性代谢途径中的活性, 通过插入的基因来增加聚合物的碳含量。这
2、些研究成果增加了我们对碳的可获取性的了解和区分不同的植物细胞器、细胞和器官类型的能力, 推动了用植物生产 PHB 及其他产物的进展。关键词： 聚-羟基丁酸酯; 新型生物聚合物; 植物; 作者简介：王彩芸, 基金：国家自然科学基金 (No.21546004 和 No.21576145) 资助Research Progress on Production of Novel Biopolymers PHB in PlantsWang Caiyun Zheng Zhenkun College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science
3、and Technology; Abstract： Poly (R) -3-hydroxybutyrate (PHB) is a fully biodegradable and biocompatible polymer material that can be used as a substitute for traditional plastics in the plastics, chemical and feed markets.Huge commercial application value.In recent years, some progress has been made
4、in the production of novel biopolymer PHB in plants, which is expected to provide renewable industrial raw materials through agricultural production, which makes it has a wide range of development prospects.Increasing the yield of PHB involves controlling the promoter to drive transgene expression,
5、reducing the activity of the endogenous enzyme in competitive metabolic pathways, and increasing the carbon content of the polymer through the inserted gene.These experimental studies have increased our understanding of carbon availability and the ability to partition different types of plant organe
6、lles, cells and organs, which are very useful for the production of PHB and other novel molecules in plants.Keyword： Poly (R) -3-hydroxybutyrate; Novel biopolymers; Plants; 早在 1925 年, 法国 Lemoigne 是第一个从巨大芽孢杆菌的细胞中观察到并提取分离了聚羟基链烷酸酯 (polyhydroxybutyrate, PHB) , 它具有良好降解性, 其降解产物属于天然产物。但是, 一直不为人们重视。后来, 由于环境
7、压力和能源危机, PHB 才得到重视。随着对 PHB 的进一步探讨研究, 人们了解到 PHB是一种天然产物, 可以用来储存微生物的能量并参与代谢过程。聚-羟基丁酸酯 (polyhydroxybutyrate, PHB) 是发现最早、研究最多的聚羟基链烷酸酯 (polyhydroxyalkanoates, PHA) 。通过细菌和遗传工程菌发酵、活性污泥生产等方法都可以生产 PHB。植物细胞是微型制造厂, 能够生产一系列的生化物质和原料来满足自身生长和繁殖的需求, 防御有害物质和疾病, 监控和与周围的生长环境相互作用。植物本身能够生成一些聚合物, 例如广泛应用于人类日常生活的淀粉、纤维素、半纤维素
8、和木质素。地球上绝大部分天然橡胶是由橡胶树或天然橡胶树生产的, 它们广泛地应用于轮胎、管道、手套和其他消费品。植物所制成的生物材料可以是通过增加编码酶活性的基因, 该基因能够将内源性的植物代谢物转化为一种聚合物, 而且生成的聚合物是该植物自身不能生成的。因此可以尝试使用植物生产 PHB (Somleva et al., 2013) 。聚-羟基丁酸酯 (PHB) 是一种在塑料、化学品和饲料市场有潜在应用价值的 PHA, 本研究将重点介绍怎样用植物生产高产量的生物聚合物 PHB。PHB 的生产已在油料作物实现并被认为是用于生产聚合物的原料和提供能量的理想目标物 (图 1) 。1 用植物生产 PHB
9、编码合成 PHB 酶的基因, 最初是从真氧产碱杆菌中提取的, 它们是从上世纪 80年代末的菌株群中得到的 (Schubert et al., 1988;Slater et al., 1988;Peoples and Sinskey, 1989a;Peoples and Sinskey, 1989b) 。随后科学家用非常短的时间用这些基因改造拟南芥的基因结构以生产聚合物 (Poirier et al., 1992) 。尽管最初聚合物的水平不高 (0.01%鲜重FWPHB) , 但这项研究为今后的工作奠定了基础。目前, 最高水平的 PHB 已在叶绿体中产生, 这很可能是由于通过乙酰辅酶 A 高通量
10、的碳生物合成了脂肪酸 (Somleva et al., 2013) 。乙酰辅酶 A 是一种重要的代谢产物, 在植物细胞的初级和次级代谢中, 脂类、氨基酸、类异戊二烯化合物和黄酮类化合物的合成中起着核心作用 (Xing and Poirier, 2012) 。到 2012 年, 应用植物生产 PHB 的显著成就和它们的意义 (表 1) 。1.1 用 C4 单子叶植物生产 PHB 的进展具有 C4 光合作用的植物是地球上最高产的植物, 包括许多主要的农作物。由于C4 植物具有一种独特的结构, 在靠近维管束的内层是鞘细胞, 鞘细胞的外层是叶肉细胞。因此, C4 植物减少了呼吸作用的浪费, 大幅度提高
11、了光合作用效率 (Langdale, 2011) 。这种特殊结构给 PHB 生产造成了困难。早期用玉米、甘蔗 (Petrasovits et al., 2007;Purnell et al., 2007;Petrasovits et al., 2012) 和柳枝稷 (Somleva et al., 2008) 的绿色组织生产 PHB, 聚合物在维管束鞘细胞的叶绿体累积量很少, 甚至没有 PHB 在叶肉细胞中产生。由于在含有 NADP-依赖型苹果酸酶的植物中叶肉细胞占整个绿色组织将近 79%, 例如玉米和甘蔗;在含有 NAD-依赖型苹果酸酶的植物中叶肉细胞占整个绿色组织将近 66%, 例如柳枝稷
12、 (Hattersley, 1984) 。这对生产和积累 PHB 是一个重大的阻碍, 因此成为一个主要的研究目标。聚合物不均匀累积可能是由于不同的竞争路径对底物的获取能力不同, 或是因为已被 C3 双子叶植物叶绿体靶向信号改变的PHB 聚合酶变成低效的靶向性 (Petrasovits et al., 2007;Somleva et al., 2008;Petrasovits et al., 2012) 。最近的几个研究已经解决了这些问题, 并成功在叶肉细胞叶绿体产生更多的聚合物。在脂质生物合成的第一步, 抑制乙酰辅酶 A 羧化酶, 该酶与 -酮硫解酶直接竞争底物乙酰辅酶 A, 改变甘蔗的基因,
13、 使得叶绿体定向控制聚合物 PHB 的生产, 并使叶子中的产量与控制植物体相比增加近两倍 (Petrasovits et al., 2013) 。对于甘蔗和柳枝稷的研究表明, 抑制乙酰辅酶 A 羧化酶的确可以增加 PHB 在叶肉叶绿体中的产量, 用荧光显微镜可以看见肉眼可见的小颗粒, 并且 C3 双子叶植物叶绿体定位信号能有效的控制 PHB 聚合酶同时在维管束鞘和叶肉细胞叶绿体中起作用, 这些通过免疫定位实验可以证实 (Mc Qualter et al., 2014) 。以前将抑制乙酰辅酶 A 羧化酶用于提高转基因烟草 PHB 的水平 (Suzuki et al., 2002) , 这些研究首
14、先可以证明这一战略可以用于增加 C4 单子叶植物 PHB 产量。提高 PHB 合成路径对于底物乙酰辅酶 A 的获取能力, 也可以通过插入基因来编码叶绿体靶向乙酰乙酰辅酶 A 合酶, 作为生产乙酰乙酰辅酶 A (链霉菌 sp.enzyme Nph T7) (Okamura et al., 2010) 的可选择的硫化酶来实现。表达 Nph T7 以及还原酶与合成酶的基因的植物, 在叶肉叶绿体中产生了许多透射电镜可见的小颗粒 PHB, 在甘蔗叶中 PHB 产量干重增加 11.8%, 这是到目前为止用 C4 单子叶植物生产的聚合物的最高水平。这些实验的成功可能是因为由于动力学性质的差异, 与硫解酶相比
15、, Npht7 对于底物的合成路径更短, 使其较内源性途经更有效地竞争底物。此外, 硫解酶优先催化乙酰乙酰辅酶 A 的硫解, 不会缩合两乙酰辅酶 A 分子, 取决于随后的生化途径中有利于此反应的步骤, 而推动 Nph T7 反应的是产物乙酰乙酰辅酶 A 的产生 (Okamura et al., 2010) 。图 1 利用代谢工程将 PHB 应用于生产塑料, 化学制品等 Figure 1 Using metabolic engineering to apply PHB to the pro-duction of plastic, chemical products and so on 下载原图表
16、 1 在植物中生产 PHB 显著的成就 Table 1 Notable achievements, PHB production in plants 下载原表 1.2 用 C3 植物光合作用生产 PHB 的研究进展也可以用 C3 植物来生产 PHB, 其中包括亚麻荠和拟南芥。亚麻荠是一种工业油料作物, 由于其高的油含量, 或许可用于航空业和其他液体燃料, 因此受到关注, 并且已经开始用种子中的质体生产 PHB。利用特定种子中的启动子表达特定序列, 可使 T2 种子的质体中 PHB 积累重量高达成熟种子的 15%, 而且在此条件下, T4 种子可以得到 13.7%的 PHB。这个结果比之前油菜的研究结果明显高出 7.7% (Houmiel et al., 1999;Valentin et al., 1999) 。在种子中引入新的 PHB 碳, 可以使碳从种子分子库里分离, 从而使种子油量减少, 并且也能满足聚合物产量的增加的需要, 但种子中蛋白质含量并不会减少。在种子中的质体中
