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1、黄鳝醛酮还原酶基因的重组表达及多抗制备 王全禾 江翱 杨震 李伟 长江大学生命科学学院 武汉大学生命科学学院 摘 要： 为实现原核表达黄鳝醛酮还原酶基因并制备其多克隆抗体, 笔者利用基因特异性引物自黄鳝肝脏 cDNA 中扩增黄鳝醛酮还原酶全长序列, 将之克隆至原核表达载体 pET-28a (+) 中, 构建了重组表达载体;经测序验证后的重组质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3) 后进行 IPTG 诱导。利用 Ni 离子亲和柱纯化了重组蛋白, 通过多次免疫新西兰兔制备了多克隆抗体;采用 Western blot 和免疫组化法鉴定兔抗醛酮还原酶多克隆抗体的特异性, 用间接 ELISA 技术检测多抗
2、的效价。结果发现成功构建 pET/Eakr 原核表达载体, 并实现了重组蛋白的融合表达和纯化;Western blot 检测表明制备的兔多克隆抗体不仅能特异性地识别来源于黄鳝 4 种组织的醛酮还原酶蛋白而且还可识别来源于黄颡鱼、团头鲂、乌鳢、鲫鱼和草鱼的同源蛋白。免疫组化结果提示该多抗可特异性识别黄鳝小肠、肝胰组织和脾脏的醛酮还原酶蛋白。制备的多抗效价达 16400。关键词： 黄鳝; 醛酮还原酶; 重组表达; 多克隆抗体; 作者简介：王全禾 (1991) , 男, 硕士研究生;研究方向:水产养殖.E-mail:.作者简介：李伟 (1976) , 男, 副教授;研究方向:鱼类分子生物学.E-ma
3、il:.收稿日期：2017-01-13基金：国家大学生创新创业训练计划项目 (201510489007) Recombinant Expression and Polyclonal Antibody Preparation of an Aldo-keto Reductase from Swamp EelWANG Quanhe JIANG Ao YANG Zhen LI Wei College of Life Science, Yangtze University; College of Life Science, Wuhan University; Abstract： A pair of ge
4、ne-specific primers were synthesized to isolate the sequence of AKR of swamp eel Monopterus albus from the liver cDNAs to recombinant expression of swamp eel aldo-keto reductase in Escherichia coli and to prepare polyclonal antibody against it.The purified products were subcloned into expression vec
5、tor pET-28 a (+) .Subsequently, the confirmed plasmid pET/Eakr was transformed into BL21 (DE3) competent cells.The positive clones were selected and were induced by IPTG.Then, the recombinant protein was purified by one step affinity chromatography with a Ni-NTA agarose column.New Zealand white rabb
6、its were immunized with the purified protein to generate polyclonal antibodies.Western-blotting and immunohistochemistry assay were performed to detect the specificity of the antibody.Indirect ELISA was used to examine the titer of the antibody.The results showed that the antiserum specifically reco
7、gnized Eakr in four different tissues of swamp eel and reacted with homologous proteins in grass carp Ctenopharyngodon idella, yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco, bluntnose black bream Megalobrama amblycephala, snakehead Channa argus and crucian carp Carassius auratus.Immunohistochemistry assay
8、revealed that the antiserum specifically reacted to Eakr in kidney, liver and intestine with antibody titer of about 16400.Keyword： swamp eel; aldo-keto reductase; recombinant expression; polyclonal antibody; Received： 2017-01-13黄鳝 (Monopterus albus) 又称鳝鱼、无鳞公子等, 为合鳃目、合鳃科、黄鳝属的唯一种。黄鳝属底栖型鱼类, 通常在富含有机质的水
9、草及水流较缓的溪流中钻洞穴居。由于肉质鲜美, 含有丰富的氨基酸和维生素, 又具有较高的药用和食用价值, 黄鳝现已成为我国及亚洲许多国家淡水养殖中重要的养殖品种。醛酮还原酶 (AKR) 是一类依赖于 NAD (P) H 的分子量为 3437ku 的单体还原酶蛋白, 在生物界广泛分布1。醛酮还原酶超家族成员众多, 包含醛糖还原酶、醛还原酶、羟化类固醇脱氢酶、2, 5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶、多元醇脱氢酶、二氢二醇脱氢酶等多种能够代谢机体羰基化合物的酶类2。该超家族的蛋白质结构存在许多共性, 如都包含一个 (/) 8的桶装结构、相似的辅酶结合结构域和一个高度保守的 Asp, Tyr, Lys,
10、His 催化四分体3-4。从功能上看, 它们在生物体应对外源性或内源性羰基化合物的解毒过程中具有重要作用5-7, 许多成员还参与了某些疾病的发生过程8。研究表明, 醛酮还原酶超家族与癌症侵袭、转移和耐药性等问题的发生密切相关9-10, 在机体抗衰老11、生物体内氧化应激2、致癌化合物的降解12-13、糖尿病并发症及肿瘤发生2,14-15等过程都有醛酮还原酶超家族的参与。相对于哺乳动物, 关于鱼类的醛酮还原酶基因及其功能的研究国内外鲜有报道。国外有学者研究了苯并芘处理尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 后其肝组织醛酮还原酶 AKR1A1 基因的表达情况, 认为尼罗罗非鱼的
11、 AKR1A1 分子可能在苯并芘解毒过程中具有重要的作用16。而针对其他鱼类尤其是重要淡水养殖品种黄鳝的醛酮还原酶基因及其功能的报道, 目前尚无文献记载。前期, 笔者于实验室克隆了黄鳝醛酮还原酶基因 Eark, 并发现该基因和已知醛酮还原酶家族的成员仅具有约 25%的同源性。随后, 笔者构建了该基因的原核表达载体, 利用 Ni 离子亲和层析柱进行了重组蛋白的分离和纯化, 并免疫新西兰兔 (Oryctolagus cuniculus) 制备了其多克隆抗体并进行了免疫组化和 Western blot 检测。该研究结果对于探究鱼类醛酮还原酶基因的功能具有重要的参考价值。1 材料与方法1.1 试验材料
12、及试剂试验所用的黄鳝、草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 、黄颡鱼 (pelteobagrus fulvidraco) , 团头鲂 (Megalobrama amblycephala) 、乌鳢 (Ophiocephalus argus、鲫鱼 (Carassius aumtus) 均购自荆州水产市场;试验所用的新西兰纯种白兔购自荆州兔业养殖合作社。pET-28a (+) 载体购自Novagen 公司;限制性内切酶 EcoR和 Hind、LA Taq、T4 连接酶购于大连宝生物;DH5 和 BL21 (DE3) 感受态细胞、pEASY-T1 载体、蛋白质 marker 购于
13、北京全士金;IPTG、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自 Sigma 公司;anti-His一抗、HRP 标记羊抗兔 IgG 购于武汉博士德公司;DAB 显色试剂盒购自于武汉谷歌生物;动物组织总蛋白提取试剂盒购于上海贝博生物;Ni 离子亲和层系柱购于上海七海生物;其他试剂均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 原核表达载体的构建根据黄鳝醛酮还原酶基因的 cDNA 序列 (序列号:KF819395) , 设计了一对特异性引物 re-ex-F (5-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3) 和 re-ex-R (5-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACT-CATCGC-
14、3) 以扩增该基因的成熟肽序列。分别在上、下游引物添加了 EcoR和 Hind酶切位点。扩增产物经过双酶切回收纯化, 与同样双酶切的 pET-28a (+) 表达载体进行连接。连接产物转化 DH5 感受态细胞后进行菌液 PCR 初检和序列测定验证, 测序正确的质粒命名为 pET-Eakr。1.2.2 重组蛋白的诱导表达取 1ng 重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) , 涂布于含50g/mL 的卡那霉素平板上进行 37过夜培养。挑取阳性转化子于含50g/mL 的卡那霉素的液体 LB 培养基中 37、200r/min 摇培至指数生长期后添加 IPTG,
15、 使终浓度为 0.1 mmol/L, 培养 3h。离心收集菌体进行超声波破碎, 然后加入 5上样缓冲液进行 12%SDS-PAGE 电泳检测目标蛋白的表达情况。1.2.3 重组蛋白的纯化将上述阳性菌株按 1100 的比例接种于 500mL 含有 50g/mL 的卡那霉素的新鲜液体培养基中, 200r/min 37恒温培养过夜。离心收集菌体, 用 50mmol/L的 PBS (pH 8.0) 悬浮菌液进行超声波破碎。超声波破碎后收集沉淀部分, 用裂解缓冲液 (6mol/L 盐酸胍, 10 mmol/L 咪唑, 50 mmol/L PBS pH=8.0) 洗涤3 次后, 加入适量裂解缓冲液溶解,
16、上清液经过滤后用 1mL 的亲和层析镍柱HisBinding-Resin 进行纯化, 纯化的蛋白经含 6、3、1.5、0.5mol/L 和0.1mol/L 的盐酸胍缓冲液梯度透析复性后, 使用透析袋浓缩, 用 BCA 法测定蛋白含量。1.2.4 多克隆抗体的制备将纯化的蛋白和等体积弗氏完全佐剂进行充分乳化后按照 200g/kg 的量采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔。每次间隔 7d, 共注射 8 次。自第 2 次免疫开始, 用经弗氏不完全佐剂充分乳化的抗原进行加强免疫。最后 1 次加强免疫后 1 周后采全血分离抗血清, 加入 30%甘油后, 于-20分装保存。以第 1 次免疫前采集的兔血清为阴性对照。1.2.5 多克隆抗体特异性的 Western blot 分析首先将含有空白质粒的菌株总蛋白 (阴性对照) 、阳性菌株总蛋白 (阳性对照) 和纯化的蛋白进行 SDS
