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1、多房棘球蚴 LDH 基因的克隆表达及免疫原性研究 何顺伟 李洪清 李晓燕 赵瑞雪 魏晓星 青海大学生态环境工程学院 青海大学附属医院 摘 要： 目的克隆表达青海省多房棘球蚴 (Echinococcus multilocularis, Em) 乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase, LDH) 基因, 鉴定 EmLDH 重组蛋白的免疫原性, 初步评价其免疫诊断价值。方法 采用 RT-PCR 方法克隆 EmLDH 基因, 将其连接入 pET15b 表达载体中, 构建重组表达质粒 pET15b-EmLDH, 转化至 E.coli Rosetta (DE3) 感受态细胞进行诱导表达。
2、通过 SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达形式, Ni-IDA 树脂亲和层析纯化重组蛋白。通过 Western blotting 法鉴定EmLDH 重组蛋白的免疫原性, ELISA 法检测泡型包虫病患者 (57 例) 、囊型包虫病患者 (33 例) 和正常人 (50 例) 血清, 初步评价 EmLDH 重组蛋白的免疫诊断效果。结果 成功克隆了 EmLDH 基因并表达纯化出相应的重组蛋白。Western blotting 结果显示, EmLDH 重组蛋白可被泡型和囊型包虫病患者血清识别, 而不被正常人血清识别。ELISA 结果显示, EmLDH 重组蛋白对泡型和囊型包虫病患者血清的诊断敏感性分别
3、为 84.21%和 84.85%。结论 EmLDH 重组蛋白具有较高的免疫原性, 对包虫病具有较好的免疫诊断价值。关键词： 多房棘球蚴; LDH 基因; 克隆; 表达; 免疫原性; 作者简介：魏晓星, Email:收稿日期：2017-03-23基金：青海省科技项目 (No.2016-ZJ-746) 资助Cloning and prokaryotic expression of LDH gene in Echinococcus multilocularis and immunogenicity research of the recombinant proteinHE Shun-wei LI H
4、ong-qing LI Xiao-yan ZHAO Rui-xue WEI Xiao-xing Department of Ecologically-environment Engineering, Qinghai University; The Affiliated Hospital of Qinghai University; Abstract： The present study aimed to clone and express the EmLDH gene of Echinococcus multilocularis in Qinghai Province, identifying
5、 immunogenicity of EmLDH recombinant protein and evaluating its immune diagnostic value preliminarily.EmLDH genes were cloned by RT-PCR technology and linked into pET15 bvector.Recombinant expression pET15b-EmLDH vectors were constructed and transformed into E.coli Rosetta (DE3) competent cells.Reco
6、mbinant proteins were induced and expressed.Expression forms of recombinant proteins were detected by SDS-PAGE.Recombinant proteins were purified by affinity chromatography of Ni-IDA resin.Immunogenicity of recombinant proteins was identified by Western blotting.Serum samples from patients with alve
7、olar echinococcosis (57 cases) , cystic echinococcosis (33 cases) , and healthy persons (50 cases) were examined by ELISA, which evaluated preliminarily immune diagnosis effect of EmLDH recombinant proteins.Results showed that EmLDH gene was cloned successfully and the recombinant proteins were expr
8、essed and purified.Results of Western blotting showed EmLDH recombinant proteins were recognised by serum samples from patients with alveolar echinococcosis and cystic echinococcosis, but not by serum samples from healthy persons.Results of ELISA showed that diagnostic sensitivities of EmLDH recombi
9、nant protein reacted with serum samples from patients with alveolar echinococcosis and cystic echinococcosis were 84.21% and 84.85% respectively.EmLDH recombinant proteins of Echinococcus multilocularis have high immunogenicity and good immune diagnostic value for echinococcosis.Keyword： Echinococcu
10、s multilocularis; LDH gene; cloning; expression; immunogenicity; Received： 2017-03-23多房棘球绦虫是一种可引起人兽共患病的寄生虫, 集中分布于北半球高纬度地区1。由其幼虫侵染机体引起的泡型包虫病对人体健康和畜牧业发展危害极大, 是许多国家和地区严重的公共卫生问题之一2-3。快速灵敏的诊断方法对该病的防治十分重要。免疫诊断是包虫病临床诊断研究的一项重要内容, 选择适宜的特异性抗原是决定包虫病免疫诊断准确性的关键4-5。目前, 利用基因工程技术筛选和鉴定棘球蚴特异性抗原是包虫病免疫诊断研究的主要方向6-8。本研究以
11、青海省多房棘球蚴原头节 cDNA 为模板克隆 EmLDH 基因, 表达纯化 EmLDH重组蛋白, 通过 Western blotting 法鉴定该蛋白的免疫原性和 ELISA 法初步评价其免疫诊断价值, 为后续基于 EmLDH 蛋白的包虫病免疫诊断的研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源Em 原头节取自青海西宁地区经感染 Em 的小鼠完整包囊, 无菌条件下抽吸囊液, 分离原头节, PBS 缓冲液清洗干净后于-80保存。泡型包虫病患者血清 (57 例) 和囊型包虫病患者血清 (33 例) 取自青海省各大医院。所有患者均经快速免疫诊断试剂盒及影像学诊断确诊或手术确诊。正常人血
12、清 (50 例) 取自医院健康体检者。1.1.2 主要试剂2Taq PCR MasterMix、D2000DNA Marker、TIANScript RT Kit、6DNA loading buffer、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、pGM-T 连接试剂盒、DH5感受态细胞、快速质粒小提试剂盒、GeneGreen 核酸染料均购自北京天根公司。TRIzolLS Reagent、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、辣根过氧化物酶标记 (HRP) 的羊抗人 IgG (HRP-IgG) 、DAB 底物显色液试剂盒、ELISA 终止液、ELISA 包被液 (1) 、1PBST、抗体稀释液 (普通型)
13、 、单组分 TMB 显色液、5%BSA 封闭液、Difco Skim Milk 脱脂奶粉均购自上海索莱宝公司;pET15b 原核表达载体、Rosetta (DE3) 感受态细胞、非预染蛋白 marker、包涵体溶解液、5protein loading buffer、PVDF 膜、Ni-IDA 琼脂糖蛋白纯化试剂盒均购自上海生工公司。NdeI/XhoI 限制性内切酶、考马斯亮蓝染色试剂盒 (常规法) 均购自碧云天生物科技研究所。1.2 方法1.2.1 目的基因克隆和测序参照 GenBank 上公布的细粒棘球蚴 EgLDH 基因 (GenBank:No.HM748917.1) 设计引物, 其中上游
14、引物序列为:5-CGCCATATGTCTGTGGAGGGGTTGTTG-3, 下游引物序列为:5-CCGCTCGAGTCACCACTT-GATGCCTGCGATAATC-3 (下划线部分为NdeI/XhoI 酶切位点, 两端为保护性碱基) , 扩增片段大小为 996bp, 由上海生工公司合成。使用 TRIzol 法提取原头节总 RNA, 按 TIAN-Script RT Kit 操作说明反转录成cDNA, 并以此为模板进行 PCR 扩增。扩增体系 (20L) :上、下游引物 (10mol/L) 及 cDNA 模板各 1L, 2Taq PCR MasterMix 10L, ddH 2O 7L。扩
15、增条件:94预变性 5min;94变性 30s, 63退火 30s, 72延伸1min, 35 个循环;72终延伸 10 min。PCR 产物于 1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收。随后将目的片段与 pGM-T 载体连接, 转化入 DH5 感受态细胞, 涂布于含氨苄青霉素的 LB 平板上 37过夜培养。挑取单克隆经双酶切及菌液 PCR 鉴定正确后, 将阳性菌液送上海生工公司测序。1.2.2 重组质粒的构建和鉴定将回收纯化的 EmLDH 基因的 PCR 产物同 pET15b 表达载体分别用 NdeI 和 XhoI 双酶切, 电泳检测酶切产物并切胶回收目的基因片段和线性化的表达载体。将回收产物连接构建重
16、组表达载体 pET15b-EmLDH, 转化至 E.coli Rosetta (DE3) 感受态细胞中, 涂布于含氨苄青霉素 (50g/mL) 和氯霉素 (34g/mL) 的 LB平板上 37培养过夜。挑取单克隆经双酶切及质粒 PCR 鉴定正确后送测序。1.2.3 重组蛋白的表达和纯化将重组菌按 1100 的比例接种到含氨苄青霉素和氯霉素的 5 mL LB 液体培养基中 37振荡培养。当菌液吸光度 OD600值达 0.6 时, 加入终浓度为 0.5 mmol/L的 IPTG, 分别于 20诱导过夜, 37诱导 4h。吸取 1mL 菌液 8 000r/min 离心收集菌体, 加入 500L PBS 缓冲液悬浮菌体, 超声破碎, 12 000r/min 离心分别收集上清和沉淀, 沉淀用 500L 包涵体溶解液溶解。分别从各组中取 40L样品和 10L 5protein loading buffer 混匀, 沸水浴
