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1、块菌菌根培育技术研究进展 张笑萍 叶雷 李小林 张小平 四川农业大学资源学院 四川省农业科学院土壤肥料研究所 摘 要： 块菌是一类食药两用真菌, 且产量稀少, 具有巨大的商业价值。作为一类外生菌根菌, 块菌需要侵染宿主植物并与其共生完成自身的生命周期。在人工菌根化合成时, 需要选择适宜树种进行无菌苗培育, 并处理菌种制成菌剂进行接种。在此培育过程中, 基质的处理、接种的方式及密度、菌剂的浓度均会对培育质量造成影响。此外, 其他微生物菌落也会促进或抑制菌根的生长。菌根形成后, 需要用传统形态学以及分子生物学技术对菌根进行检测与鉴定, 以确定培育出的菌根是否为接种所用块菌。阐述了块菌的侵染机制、接
2、种技术及在菌根培育过程中影响菌根合成的因素, 介绍了块菌菌根培育技术的研究现状并提出了培育时应注意的问题。关键词： 块菌; 菌根化; 接种; 培育技术; 生命周期; 作者简介：张笑萍, 四川农业大学本硕连读学生。主要从事块菌相关研究。联系电话:13348809873。E-mail:作者简介：张小平, 博士, 教授, 主要从事微生物应用和食用菌研究。E-mail:收稿日期：2017-06-08基金：四川省科技支撑计划项目 (2016NYZ0040、2017NZ0011) Received： 2017-06-08块菌 (Truffles) , 也称松露, 是一类地下食药两用真菌, 隶属子囊菌门 (
3、Ascomycota) , 块菌科 (Tuberaceae) , 块菌属 (Tuber) 。目前, 已发现有至少 180 个不同种的块菌1。块菌具有独特的香味、口感和营养价值, 并且含有对人类有益的活性物质, 是世界上最珍贵的可食用菌根菌之一, 由于产量稀少, 在市场上有很高的经济价值。如黑孢块菌和意大利白块菌是两种经济价值极高的块菌, 其中黑孢块菌主要分布在地中海沿岸的某些国家, 如意大利、法国、西班牙等2, 其外表崎岖不平, 呈小凸起状, 色泽介于深棕色与黑色之间, 味道奇特, 被欧洲誉为“厨房里的黑钻石”“上帝的食物”。在我国, 主要的商业块菌是印度块菌, 印度块菌呈黑褐色, 偶呈红褐色
4、, 虽然其经济价值低于上述两种块菌, 但在食用菌市场亦有广阔的前景3。除此之外, 会东块菌、凹陷块菌、脐凹块菌等也在我国有所分布4。块菌是外生菌根菌, 其生长需要经历三个阶段, 即菌丝体的萌发、外生菌根的发育、子囊果的形成5。因此, 块菌必须与适宜树木营共生生活, 与树木根系形成外生菌根, 进而产生子囊果原基, 最终其逐渐膨大形成块菌子囊果。块菌菌根合成是块菌被人类生产利用的基础。所以, 块菌菌根的培育技术在块菌的生产、生理生态研究、人工栽培及块菌林的营建等方面尤为重要。同时, 研究块菌菌根的培育, 可将菌根生物技术应用于林业生产, 能够促进苗木生长6。法国是世界最早用半人工模拟栽培技术进行黑
5、孢块菌商业化生产的国家7。近10 年来, 黑孢块菌外生菌根的基因组已经公布, 这为人类了解更多有关块菌生物学特性提供了难得的机会8。目前, 国内外的学者已对不同种类块菌对不同宿主植物的侵染、接种技术及其分离鉴定、块菌的遗传多样性、块菌的人工栽培与造林技术等方面有了大量的调查研究。笔者对此进行阐述, 为今后更好地研究和生产块菌、挖掘块菌的潜在价值提供参考。1 块菌的侵染及相关机理1.1 菌根化的形成块菌是外生菌根菌, 需要与其它外生菌根型树种根系共生形成菌根, 如与榛子、华山松、云南松等宿主植物的根系形成共生体系8。子囊孢子在适宜条件下萌发菌丝, 然后侵染宿主植物的根尖, 形成“菌丝套”, 就像
6、是人的手掌佩戴手套一样, 与宿主植物形成共生体系, 即外生菌根9, 这些外生菌根与宿主植物形成了共生机制, 一方面可以供给植物吸收的水分和养分, 另一方面又可以从植物根中得到营养。形成菌根后, 会进一步长出新的菌丝体, 菌丝继续不断繁殖发育, 慢慢演变成子囊果, 最终形成子囊果。菌根的形成可能是由于植物产生根分泌物诱导的, 因为植物能通过分泌根系分泌物诱导根际微生物, 并且植物基因型、土壤类型是微生物群落构成成型的重要驱动力10。由此可推测, 受宿主植物诱导后, 孢子萌发并产生大量的菌丝, 菌丝包围在苗幼嫩的根尖表面, 致使增粗生长较快, 形成形状较为膨大的菌根, 并且通常会被菌丝套所覆盖11
7、。因此, 在培育期间, 当观察到块菌与宿主植物形成菌根时, 即块菌成功侵染了宿主植物。一般来说, 在一定时间范围内, 随着培育时间加长, 观察到的菌根数量会增多。在电镜下可以看到真菌菌丝伸入根皮层细胞间交织形成菌丝网 (称为哈氏网) 。宿主和菌根菌的代谢产物将会经过哈氏网的网络作双向运转, 菌根会向宿主植物提供矿质营养, 并减缓宿主植物的生存压力, 比如抗旱, 而宿主植物会提供碳源以供块菌完成其生命周期8, 同时菌丝在根表蔓延形成菌丝套, 可替代根毛吸收养料和水分。因此, 可根据培育后观察结果计算出块菌感染率, 也可以以菌根形成后宿主植物各种生物量为指标, 从而得到不同块菌菌根在不同培育条件下
8、最佳生长状况的条件以及其它有关结论。1.2 块菌的生命周期块菌的生命周期被认为分为三个时期:生殖期、营养期、共生时期, 然而实际情况相当复杂。大量的分子生物学研究显示, 波氏块菌的菌丝体在纯培养条件下繁殖时, 以及在子实体当中都存在腐生行为12。由于许多因素的干扰, 很多研究对块菌生命周期的了解仍然存在许多疑惑:一方面, 因为对孢子的萌发缺乏完整的试验系统, 无法对所需菌丝体进行传统的培育;另一方面, 不同于其他丝状子囊菌, 控制块菌异宗配合的交配型基因还在研究中13。随着研究的深入, 在天然黑孢块菌中, 发现了含有一对等位基因 (MAT1-1-1 及 MAT1-2-1) 的单个交配型基因,
9、此基因控制了块菌的性演变。试验发现, 块菌中含有的营养组织 (产孢组织) 与宿主植物根系的外生菌根具有相同的交配型基因, 可初步认为形成的外生菌根在子实体形成的过程中扮演了雌性的角色, 而在土壤中含有相反交配型基因的菌丝或细胞结构扮演了雄性的角色, 证明了块菌的生命周期是雌雄异体的, 也证明了此物种是异型杂交的8。并且在建立共生系统的宿主植物中检测到的 MAT1-1-1 要显著的多于 MAT1-2-1, 说明 MAT1-1-1 菌株在竞争中更占优势14。不仅仅是交配基因型的存在, 其他多种因素也涉及到块菌的产量, 其更详细的代谢途径也通过基因组分析正在研究中。研究证实, 菌丝、菌丝体和子实体会
10、渐渐散发出代谢分子以维持必要的生存, 而这些代谢分子会抑制周围种子的发芽、抑制野草或其他生物菌落的生长、打破植物的激素平衡, 从而产生“火烧圈”现象15。通常情况, “火烧圈”的出现在块菌产生子实体之前, 但是“火烧圈”的出现并不意味着宿主植物一定会生产出块菌16。图 1 块菌“火烧圈” 下载原图在块菌的生命周期中, 会散发出挥发性有机化合物 (VOCs) , 这些代谢物分子目前被认为是对造成“火烧圈”现象有重要影响的生化药剂。冷冻干燥储存是能够有效地保留块菌芳香性中关键成分的方法17。一些微生物对块菌芳香族化合物的产生也有不可忽视的作用。因此, 对块菌生命周期中产生的代谢物分子进行的研究越来
11、越多。2 块菌菌根的培育2.1 材料的准备及处理2.1.1 选择块菌接种材料及宿主植物块菌并不是对所有宿主树种都可以侵染, 而是具有一定的专一性和选择性。在选择材料时, 应该选择适宜的宿主进行接种, 这是块菌菌根培育成功的基础, 并且不同的块菌接种材料对菌根培育条件适应性也不同。一些接种材料, 如意大利白块菌, 许多栽培方式都难以成功, 其菌根在能生产块菌的种植园中十分稀少12, 在野外采样中, 通过多位点分子标记电泳的方法, 其外生菌根只被鉴定出一次12。块菌最常见的宿主树种有榛子、栎树、云南松、华山松等7,9, 我国也有接种美国薄壳山核桃的案例, 近年研究报道, 美国山核桃可与勃良第块菌菌
12、根化, 并且可相互促进其产量, 到达更好的收益18。有研究显示, 黑孢块菌对麻栎、云南松、马尾松幼苗人工接种均有较好的侵染效果并形成菌根, 可见黑孢块菌对树种的适应范围较广, 侵染专一性不是绝对的19。而印度块菌也并不是一个专性共生菌种, 而是属广谱型共生菌根菌20。目前, 已有 16 种宿主植物被证明可以与印度块菌共生, 如华山松、板栗、云南松、毛叶青冈、园叶杨等21, 比黑孢块菌更适合进行人工种植22。另外, 即使是同一树种, 不同性质的幼苗对块菌的侵染也有一定影响, 例如:黑孢块菌在无性系苗根系上形成菌根更加容易23。2.1.2 育苗及接种基质基质除提供幼苗和菌根适宜的生长环境, 提供营
13、养外, 还对植物起支撑作用, 因此基质的选择和筛选对菌根苗的培育十分重要。基质的理化特性如碳氮比、p H、机械特性等均对块菌菌根合成有一定影响24。块菌菌丝共生于植株的根系, 植株根系的发达程度对感染接种的成功率、菌根的形成等都具有很大的影响, 为培养发达、健壮的根系, 在基质的选择上, 宜优先选择质地疏松、透气、不易板结、营养物质较为全面的天然基质或人工配制基质25。为了减少其它共生真菌的竞争性影响, 基质需要进行高温灭菌, 普遍情况下, 基质采用一定比例混合均匀的蛭石、珍珠岩或泥炭土、钙质土、河沙等, 并需要测定其 p H, 大部分的块菌需要 p H78 的钙质土, 而波氏块菌能够承受微酸
14、性的土壤13。一般来说, 育苗基质和接种基质的 p H 有差异, 育苗基质其 p H 要求为6.57.0, 可加入石灰或石灰石进行调整使接种基质 p H 为 7.07.511, p H调节之后, 一般在 121126高温下灭菌 2 h。根据弓明钦等人的报道, 黑孢块菌适合于在 p H 为 6.57.0 的土壤发生, 当基质 p H 在 6.5 时, 幼苗的各项检测生理指标都优于其它 p H 条件26。从基质中加入营养物质的种类来看, 一定量的天冬酰胺等有机氮源会极大地促进块菌的菌根合成, 过高则出现抑制作用;从元素种类来看, 中等量的磷素对菌根合成有促进作用, 不同金属离子对块菌菌丝体生长促进
15、作用的大小依次为CaNaKMg2+23。以酵母浸粉为氮源和以硝酸铵为氮源对印度块菌菌丝体生物量也有一定差异27。有学者通过正交试验法研究得出了印度块菌最适液体培养基成分, 并指出碳源主要对细胞生长和活性生物成分的合成有较大影响, 乳糖的利用率最差, 麦芽糖的利用率最高。因此, 配制基质时, 应注意调节 p H 以及营养成分, 在幼苗生长过程中, 其自身对营养物质的消耗以及代谢物的产生会导致上述指标发生变化, 应注意调节维持其相对稳定11。2.1.3 无菌苗的培育无菌苗的培育一般在每年 3 月, 种子经过春化处理, 发芽率更高, 在通常情况下, 用清水将除去空壳种子的树种冲洗干净, 用一定浓度的
16、 H2O2溶液或高锰酸钾溶液浸种消毒一定时间, 之后用无菌水冲洗掉表面残留的溶液, 再将种子用无菌水浸泡一段时间, 不同宿主植物所需浸泡时间不同, 并每隔一段时间换一次水。将处理过的种子播入已灭菌的混合基质中催芽, 一般经过检测合格可用于菌根苗的培育。一般苗龄达 3 个月, 根部开始木质化即可进行接种。2.2 接种无菌苗2.2.1 接种材料的制备将块菌子实体表面经 75%的酒精消毒杀菌处理, 粉碎过后与无菌河沙或灭菌土等物质按一定比例混合制成孢子接种材料或将块菌子囊果破碎并过筛后与无菌水按一定配比配制成孢子悬浮液, 用于接种。为了利于菌剂中子囊孢子的萌发, 新鲜子实体可以低温储存一定时间, 如:放入冰箱中存放几天23。接种前, 进行接种体或培养液的分子基因型检测, 这样可以避免其他生物感染
