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1、1分子生物学实验新疆农业大学农学院生物技术系2实验 1 植物总 DNA 的提取和紫外分析一、实验目的了解植物 DNA 提取的主要方法及其原理，掌握 SDS 法或 CTAB 法抽提植物总 DNA 的基本程序和操作要求。二、实验原理核酸分子是基因工程研究的主要对象，核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。核酸包括 DNA 和 RNA 两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体 DNA 为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器 DNA为双链环状分子。一般地说，总 DNA 主要是指基因组 DNA（genomic DNA），即细胞核内的染色体 DNA 分
2、子。植物总 DNA 的抽提常采用两种方法：SDS 法和 CTAB 法。CTAB 法：简便、快速，DNA 产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。CTAB 是一种非离子去污剂，植物材料在 CTAB 的处理下，结合 65水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.10.5mM NaCl）下，CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用 7075%酒精浸泡可洗脱掉 CTAB。再经过氯仿/异戊醇（24:1 ）抽提去除蛋
3、白质、多糖、色素等来纯化 DNA，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。SDS 法：离子去污剂，过程长，纯度高。三、主要仪器、试剂、耗材1、植物材料叶片（根、茎、花、果等） 2、主要仪器及试剂微量高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、离心管、移液枪、枪头等。CTAB 提取缓冲液（2%CTAB，1.4M NaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl，pH8.0 ）、氯仿/ 异戊醇（24:1,v/v）、无水乙醇、75%乙醇、 TE 缓冲液。四、实验方法与步骤（一）CTAB 法提取植物叶片 DNA1、植物组织的破碎：取 0.1g 新鲜的植物叶片，在液氮中研磨至粉末状，
4、转入 1.5ml 离心管中。32、细胞的破碎：迅速加入 1ml 预热（65）的 CTAB 提取缓冲液，65水浴中保温30min 以上，每 5min 上下颠倒 1 次。3、核酸的分离：12000g 离心 5min，吸取上清液约 600l，加入等体积氯仿/ 异戊醇（24:1），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。重复操作 2 次。4、12000g 离心 5min，取上清于一新 1.5ml 离心管，加入 0.6 倍体积的预冷的异丙醇溶液，混匀，-20放置 10-30min。5、12000g 离心 10min，去上清，用 75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥约 30min。6、核酸的溶解：加入 20lTE
5、缓冲液或无菌水，混匀即可。（二）DNA 的定量分析核酸的纯度和浓度可以用紫外分光光度计测定，OD 值代表光密度，下标数字表示光波长，DNA 样品 OD260/OD280 值为 1.8，RNA 样品 OD260/OD280 值为 2.0，表明样品纯度较好。若低于此值，则样品中可能有蛋白质污染。OD 260 的读数用于计算样品中的核酸浓度，OD值为 1 相当于大约 50g/ml 双链 DNA 或 40g/ml 单链 RNA。1、取 DNA 原液 5l 稀释至 3.0ml，用紫外分光光度计测定 230nm、260nm 及 280nm 的吸光值。2、DNA 浓度（mg/mL）=50（260nm 的读数
6、）稀释倍数分光光度法是测定物质浓度的常用方法，DNA 或 RNA 链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强的吸收能力，因而在 260nm 处具有一个强烈的吸收峰；蛋白质中含有的色氨酸和酪氨酸在 280nm 波段有一强烈的吸收峰，利用上述特点可以测定物质含量。教材的公式中“50”的含义是：在标准厚度为 1cm 的比色杯中，OD 260（OD 是光密度 optical delnsity 的缩写）为 1 相当于 50mg/mL 的 dsDNA（双链 DNA）， 40mg/mL 的 RNA，37mg/mL 的ssDNA（单链 DNA）以及 30mg/mL 的寡核苷酸，因此若是测定 RNA 的含量，50 应该
7、换为40，其他物质以此类推。3、DNA 纯度：1.7A260/A2801.9五、实验结果处理 记录提取的 DNA 样本的 OD 值并计算样本浓度。4实验 2 总 RNA 的提取和尿素变性胶电泳一、实验目的 通过本实验，学生了解 RNA 的结构和特点，学会使用 Trizol 法提取植物总 RNA，学习和掌握总 RNA 的检测实验技术和实验原理。二、实验原理RNA 的提取是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础。但 RNA 很容易被内源及外源的 RNase 降解，所以要得到未被降解的、不含 DNA 与其它杂质的 RNA 是进行分子生物学研究的前提。目前较为成熟的分离 RNA 的方法有许多，用于植物
8、细胞总 RNA 的提取主要有苯酚法、异硫氰酸胍法、氯化锂沉淀法、SDS/ 酚抽提法，或应用商品化的 Trizol 试剂和Qiagen 等各类试剂盒进行提取。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，内含较多的多糖、脂质、多酚等次生代谢物，同种植物的不同组织和不同植物的同种组织材料，其 RNA 的提取方法也会有很大差异。适宜的 RNA 提取材料处理方法也不尽相同。 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总 RNA 的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持 RNA 的完整性。在氯仿抽提、离心分离后， RNA 处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀 RNA。用这
9、种方法得到的总 RNA 中蛋白质和 DNA 污染很少，可以用来做 Northern，RT-PCR，分离 mRNA，体外翻译和分子克隆等。三、主要仪器、试剂、耗材1、无 RNA 酶的 1.5mlEppendorf 管、枪头、研钵，微量高速离心机，琼脂糖凝胶电泳槽，移液器，一次性手套等。2、实验材料：植物新鲜叶片3、实验试剂：Trizol；电泳缓冲液：0.025M 柠檬酸（pH3.5） ；制胶缓冲液：6M 尿素+0.025M 柠檬酸（pH3.5 ） ；上样缓冲液：6M 尿素 +0.025M 柠檬酸（pH3.5）+20%蔗糖+0.0025%溴酚蓝四、实验步骤（一）总 RNA 的提取1、取 0.1g
10、左右新鲜植物叶片置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。2、将粉末移入预冷的 1.5ml 离心管中，加入 1.0mlTrizol，轻轻摇动离心管使混合均匀，室温放置 5min。3、加入 0.5ml 氯仿，上下颠倒混匀，室温放置 5min 后，12000rpm ，4离心 15min，上层水相移到新管中。重复操作 2 次。54、加入 0.6 倍体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，-20放置 20min。5、12000rpm，4离心 15min，弃上清。6、加入 1ml 75%乙醇，12000rpm，4离心 5min，弃上清。7、超净台内干燥 10min 左右（切忌完全干燥，否则不易溶解） 。8、加
11、 20ul 的 0.1%DEPC 处理水溶解 RNA，-80保存。（二）尿素变性胶电泳分析1、制备 2%的琼脂糖凝胶电泳。2、上样量为 5l 左右。3、电压通常为 75V 左右。6实验 3 RT-PCR一、实验目的通过本实验，学生了解小麦 18SrRNA 的特点，学会使用 PCR 进行反转录获得 cDNA 技术，学习和掌握 RT-PCR 的实验技术和实验原理。二、实验原理RT-PCR 为反转录 RCR（reverse transcription PCR）的缩写。逆转录 PCR，或者称反转录 PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR ） ，是聚合酶链式反应(PCR
12、) 的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，一条 RNA 链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行DNA 扩增。由一条 RNA 单链转录为互补 DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖 DNA 的 DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被 RNA 酶 H 降解，留下互补 DNA。RT-PCR 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种 RNA 的含量。（检测基因表达
13、的方法，参见 Northern Blot 法。RT-PCR 的关键步骤在是 RNA 的反转录，要求 RNA 模版为完整的且不含 DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（ moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。三、器材与试剂1、实验仪器：PCR 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳槽，移液器，枪头等。2、小麦 18S rRNA 扩增引物序列为(53)：18SL： CTTCTTAGAGGGACTATGGC18SR：TACGGAAACCTTGTTA
14、CGAC四、实验步骤（一）cDNA 的合成1、在冰浴的无 RNA 酶的 PCR 管中加入如下溶液：7总 RNA 1-5ugOligo(dT) 2uldNTP 2ulRNase-free ddH2O 定容至 14.5ul2、70加热 5min 后迅速在冰上冷却 2min。短暂离心后，继续加入如下溶液：5*Frist-Strand Buffer 4ulRNasin 0.5ulMMLV 1ul3、混匀后，42温浴 50min。4、95加热 5min 终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。5、加入如下溶液，PCR 扩增目的基因片段：Buffer 2.5uldNTP 1ul引物 1 0.5ul引物 2
15、 0.5ulTaqE 0.3ul上述反应液 2ulddH2O 定容至 25ul反应程序为：945min9430S5430S 30 次721min7210min4保存（二）1% 琼脂糖电泳检测分析8实验 4 动物组织总 DNA 提取与电泳分析一、实验目的：掌握动物 DNA 提取的原理及步骤。二、实验原理：动物 DNA 提取的材料来源可以是培养的细胞、血液、肝、脾、肾等组织，通常的方法是在有 EDTA 和 SDS 等去污剂存在下，用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚/氯仿/ 异戊醇抽提，可以得到动物基因组 DNA。用此方法得到的 DNA 长度为 100-150Kb。 （注：核酸本身带负电荷，结合带正电
16、荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，其作用为：1. 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2. 解聚细胞中的核蛋白；3.与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R+蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来；4.对 RNAase、 DNAase 有一定的抑制作用） 。三、实验材料与试剂：1、材料：蝗虫后腿股节；2、器材：移液器、水浴锅、台式离心机等；3、试剂：A 液：Tris 0.05 mol/L，NaCl 0.1 mol/L，Na 2EDTA 0.1 mol/L，pH 7.08.0；B 液： 5% SDS；C 液： 2 mg/ml Proteinase K。酚、氯仿、异戊醇，冰乙醇（提取所用试剂） ；10*TBE 缓冲液、0.7%琼脂糖、上样缓冲液、EB。4、实验方法：蛋白酶 K 法（酚-氯仿抽提法）四、实验步骤: 配制 DNA 提取消化液 取蝗虫腿节肌肉 加 600l 抽提液，在离心管中将肌肉磨碎 65
