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1、转基因玉米和转基因大豆盲样检测方法 李丽娜 金龙国 谢传晓 刘昌林 中国农业科学院作物科学研究所 摘 要： 转基因作物商业化发展迅速, 中国每年进口大量转基因产品并高度重视我国转基因作物研发, 制定了转基因作物及其产品的监管制度。现实迫切需要一套简单、可靠的盲样转基因成分检测方法。该研究以转基因大豆盲样 (W160982 和W160984) 和转基因玉米盲样 (W160983 和 W160985) 为研究材料, 根据农业部的转基因检测标准, 采用普通 PCR 技术对作物中转基因成分进行检测。通过与标准样品比对并测序, 最终确定盲样的转基因成分, 玉米盲样 W160983 转基因成分与标准品 M
2、ON89034 一致, W160985 与 TC1507 一致;大豆盲样 W160984 与BPS-CV127-9 一致, W160982 与 GTS40-3-2 一致。该研究提供并验证了一套玉米和大豆转基因盲样检测的方案, 在转基因作物研究生产、进出境检测、监管等方面具有实际应用价值。关键词： 转基因玉米; 转基因大豆; 盲样; 转基因成分; 检测; 聚合酶链式反应 (PCR) ; 作者简介：李丽娜, 在读硕士, 主要从事玉米分子育种研究工作作者简介：刘昌林, 通信作者, 助理研究员, 研究方向是转基因作物环境安全评价与玉米遗传育种收稿日期：2017-07-03基金：基金项目:养分高效利用转
3、基因玉米新品种培育 (2016ZX08003005) Determining Blind Samples of Transgenic Maize and Transgenic SoybeanLi Lina Jin Longguo Xie Chuanxiao Liu Changlin Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences; Abstract： Genetically modified crops developed rapidly in the world. China imports a lar
4、ge amount of products of genetically modified crops every year, and has put billions of money in genetically modified crops research. China also has established regulations for genetically modified crops and their products. Simple and reliable methods for detecting transgenic ingredients are very ur
5、gent in China. In this study, according to the detection protocols of genetically modified crops published by the Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China, blind samples of soybean (W160982 and W160984) and maize (W160983 and W160985) were detected for transgenic ingredients using th
6、e PCR technology. As a result, W160983, W160985, W160982, and W160984 are the standard sample MON89034, TC1507, GTS40-3-2, and BPS-CV127-9, respectively. The results of the blind samples were validated by sequence alignment of the PCR product. This study provided an experimental protocol for the det
7、ection of transgenic maize and soybean.Keyword： Transgenic maize; Transgenic soybean; Blind sample; Polymerase chain reaction; Received： 2017-07-03转基因是利用现代生物技术将人工分离的基因转到受体生物, 使重组生物增加人们所期望的新性状, 培育出新品种。随着转基因技术的不断发展, 转基因产品凭借其巨大的品种优势和经济效益, 呈现出较好的发展趋势。截至 2016 年, 全球 26 个国家种植转基因作物, 全球转基因作物的种植面积从 1996 年的 17
8、0万 hm 增加到 1.851 亿 hm, 增加了近 110 倍, 21 年间 (1996-2016 年) 转基因作物的商业化种植面积累计达到了 21 亿 hm21。全球转基因大豆的种植面积最大, 为 9 140 万 hm, 而中国消费了全球大豆产量的约 1/3, 大豆进口量占全球大豆进口的 65%, 其中 90%以上为转基因大豆2。玉米作为全世界总产量最高的粮食作物, 其转基因品种种植占种植总面积的 26%以上3。我国是玉米生产和消费大国, 播种面积、总产量和消费量仅次于美国4, 我国每年需进口大量玉米, 其中多数 (90%以上) 为转基因玉米1。随着转基因产品的大量生产和国际贸易的加强,
9、转基因作物的生物安全性备受关注。基因漂移是生物安全的问题之一5, 转基因作物可能通过与近缘野生种杂交而使目标基因进入野生植物。如果外源基因的表达使植物具有繁殖优势, 如抗除草剂、抗霜冻等特性, 则可能导致自然生态系统失衡, 影响生物的遗传多样性;如果这种基因漂移到杂草, 则可能产生难以控制的杂草6。考虑到这些转基因作物的安全性问题, 中国、欧盟、日本等针对转基因作物均出台了相应的检测监管政策。我国 1993 年发布了基因工程安全管理方法, 对在我国境内开展的基因工程试验提出了明确规定;1996 年发布了农业生物基因工程安全管理实施方法, 2001 年出台了农业转基因生物安全管理条理7, 以加强
10、管理农业转基因生物, 保障人类、动物、植物、微生物安全, 保护生态环境。为了保障消费者自由选择的权利, 2002 年 3 月 20 日开始施行农业转基因生物标识管理办法, 要求凡在中国境内销售的列入标识目录的转基因产品必须进行标识。2015 年新修订的中华人民共和国食品安全法规定, 生产经营转基因食品应当按照规定显著标示, 并赋予了食品药品监管部门对转基因食品标示违法违规行为的行政处罚职能。中国每年进口大量玉米、大豆, 而未经批准的违规转基因成分可能出现在进口农作物产品中。2010 年, 美国出口到中国的转基因玉米被深圳出入境检验检疫局检测出未经批准的转基因成分后退回8。面对转基因作物研究、生
11、产、贸易和消费市场, 迫切需要规范转基因监督管理, 而转基因监督管理的先决条件是转基因成分的检测, 因此, 建立快速、准确的转基因成分检测方法具有非常重要的意义。转基因成分检测主要是针对未标示、不明确的转基因样品, 通过分子生物学等方法进行检测, 其中, PCR 方法是适应性最广、灵敏度较高、技术较成熟的一种核酸检测法。本研究以两份转基因玉米盲样和两份转基因大豆盲样为研究对象, 采用常规 PCR 检测方法, 将 PCR 产物与标准品对比, 并结合测序信息进一步验证 PCR 扩增结果, 形成一套科学、准确的转基因玉米和大豆盲样检测方案, 在转基因作物进出境检测、安全监管等方面提供技术支撑。1 材
12、料与方法1.1 试验材料转基因标准品购自上海佑隆生物科技有限公司, 转基因玉米、大豆盲样为从标准品中随机抽取的样品。玉米阴性对照为非转基因玉米掖 478, 大豆阴性对照为非转基因大豆蒙豆 12, 均由中国农业科学院玉米基因编辑与分子育种创新研究组提供。1.2 试剂与引物植物基因组 DNA 提取试剂购自国药集团化学试剂北京有限公司, 常规 PCR 试剂购自 Gen Star 康润生物公司, DNA 分子量标记以及凝胶回收试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司。PCR 采用的一套引物 (表 1) 参照转基因检测标准由北京六合华大基因科技有限公司合成。表 1 玉米和大豆的转基因检测 PCR 引物
13、 Table 1 PCR primers for detecting transgenic ingredients in maize and soybean 下载原表 表 1 玉米和大豆的转基因检测 PCR 引物 Table 1 PCR primers for detecting transgenic ingredients in maize and soybean 下载原表 1.3 试验方法1.3.1 对照的设置检测过程按照 GB/T 19495.2 的规定设置阳性对照、阴性对照和空白对照。1.3.2 玉米和大豆基因组 DNA 的提取及制备玉米总 DNA 的提取采用 CTAB 法34, 大豆
14、总 DNA 的提取采用改良的 CTAB 法35。用紫外分光光度计测定提取的 DNA 浓度及纯度, 并在 1%的琼脂糖凝胶上电泳检测 DNA 质量, 用 dd H2O 将 DNA 溶液稀释到 50ng/L, 在-20冰箱保存。1.3.3 PCR 检测PCR 扩增采用 20L 反应体系:2Taq PCR Star Mix with Loading Dye 10L, 正向引物和反向引物 (10mol/L) 各 1L, dd H 2O 7L, 模板 DNA 1L (50ng/L) 。PCR 扩增条件为:94变性 5min;94变性 30s, 56 (或 58、或 60, 根据具体的检测标准) 退火 3
15、0s, 72延伸 30s, 35 个扩增循环;72延伸 5min, 12保存。PCR 扩增结束后, 用电泳缓冲液 (1TAE) 制备 2%琼脂糖凝胶, 取8L PCR 产物进行电泳, 用 M5 DL2000 DNA Marker 作相对分子质量标记。在120V、200m A 条件下电泳 2040min, 用凝胶成像系统成像。1.3.4 序列测定参照 Axy Prep DNA 凝胶回收试剂盒使用说明对 PCR 产物 (目的条带) 切胶回收, 并将阳性对照与标准对照一起送往英潍捷基 (上海) 贸易有限公司进行测序, 采用 DNAMAN 对测序结果进行比对分析。2 结果与分析2.1 DNA 提取紫外
16、分光光度计检测结果 (图 1) 表明, 提取的 DNA 质量较好, OD 260/OD280在1.82.0, 电泳检测的条带均为清晰的单一条带, 符合 PCR 分析检测要求。图 1 转基因玉米和转基因大豆基因组 DNA 电泳检测 Fig.1 Gel electrophoresis detection of genome DNA extracted from transgenic maize and transgenic soybean 下载原图2.2 盲样检测利用检测转基因玉米的 14 对引物对两个转基因玉米盲样进行检测, 结果显示盲样 W160983 在图 2-的 10 号泳道显阳性, 其 PCR 产物大小与预期大小 207bp基本一致, 推断 W160983 的转基因成分是 MON89034;盲样 W160985 在图 2-的1 号泳道显阳性, PCR 产物大小与预期大小 279bp 基本一致, 推断是 TC
