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1、蛋白质印迹法中免染技术和总蛋白定量方法的研究进展 韩欣霖 杨佳儒 宝福凯 柳爱华 昆明医科大学云南省高校热带传染病重点实验室 昆明医科大学病原生物学与免疫学系 昆明医科大学生物化学与分子生物学系 云南省公共卫生与疾病防控协同创新中心 昆明医科大学热带医学研究所 云南省热带病示范型国际科技合作基地 摘 要： 当含有蛋白质的 SDS-PAGE 胶浸泡在三氯乙酸或氯仿中时, 经三氯化合物的作用, 使得蛋白质中的色氨酸经紫外光照射会发出可见光, 因而可在 SDS-PAGE 凝胶上实现对蛋白质条带的定位与定性。免染技术即是基于此原理而发明的。基于免染技术, 我们可以检测到待测样品中的总蛋白条带的光密度,
2、 进而利用目的蛋白条带光密度与总蛋白条带光密度的比值对目的蛋白进行定量。本文就蛋白质印迹法技术中的免染技术和总蛋白定量方法的原理和优势进行简要综述。关键词： 免染技术; 肌动蛋白 (-actin) ; 微管蛋白 (-tublin) ; 甘油醛 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) ; 总蛋白定量; 作者简介：韩欣霖 (1992-) , 女, 硕士研究生;作者简介：杨佳儒 (1987-) , 男, 硕士研究生;作者简介：宝福凯, (E-mail) ;作者简介：柳爱华, (E-mail) 收稿日期：2017-04-01基金：国家自然科学基金 (81371835, 31560051, 81560596)
3、Progress of Stain-Free Technology and Total Protein Analysis in Western BlottingHAN Xin-Lin YANG Jia-Ru BAO Fu-Kai LIU Ai-Hua Yunnan Province Key Laboratory for Tropical Infectious Diseases in Universities, Kunming Medical University; Abstract： Based on the principle that after UV stimulation, the t
4、ryptophan will emit visible light when a SDSPAGE gel containing proteins be soaked in the trichloroacetic acid or chloroform, the stain-free technology was invented. By means of stain-free technology, we can examine the optical density (OD) value of total protein in samples and then, we can quantify
5、 the target protein through utilizing the OD value ratios between target protein and total proteins. Here, we summarized the principle and advantages of the stain-free technology and the total protein analysis method.Keyword： stain-free technology; -actin; -tublin; GAPDH; total protein analysis; Rec
6、eived： 2017-04-01自 1979 年首次应用以来, 蛋白质印迹法 (Western blot) 已成为测定复杂生物样品中蛋白质相对表达的关键技术。使用 Western 印迹的生物化学分析是确定复杂生物样品中相对蛋白表达量的重要工具, Western 印迹通常与大规模筛选技术如蛋白质组学结合使用, 以确认各种疾病模型中不同目的蛋白的表达1。虽然成像和试剂技术在不断提高灵敏度、动态检测范围和多重目标检测的适用性方面已经取得了显著进步, 但是在最基本的技术上几乎没有变化。在过去, 蛋白质印迹仅用于检测复杂混合物中的特定靶蛋白, 但是现在许多学术期刊要求作者在样品之间蛋白质表达的倍数变化
7、方面对 Western 印迹数据进行定量解释2。近年来开发了新方法, 涵盖了完整的 Western 印迹工作流程, 重点是样品制备和数据分析的定量免疫印迹方法。1 内参蛋白定量和总蛋白定量的比较蛋白质印迹用于特异性地测量复杂生物样品中目蛋白的相对表达量。定量测量可能由于过程不一致而产生误差, 例如转膜时蛋白质转移不均匀, 包括样品制备和加样错误, 以及转膜时蛋白质转移不均匀。这些非样本相关误差需要通过归一化的方法来弥补。目前通常采用 2 种数据标准化方法:内参蛋白 (house keeping protein, HKP) 标准化和总蛋白标准化 (total protein normalizat
8、ion, TPN) 3。1.1 -actin 等内参蛋白在 Western 印迹实验中不是一个可靠的上样对照4传统上, 由于缺乏累积发光线性和有限的定量再现性, 使用 ECL (增强化学发光) 的 Western 印迹被称为半定量技术5。随着更敏感的荧光标记的发展, 其表现出比常规 ECL 检测更大的可量化的线性范围、灵敏度和稳定性, 蛋白质表达的分析可以被合理地称为“定量”6。因此, 必须以更高的精确度确保样品上样的均匀性, 以避免在使用这些更高分辨率的工具时错误的数据采集7。为了准确测量样品中的蛋白质水平, “上样对照 (loading control) ”蛋白质通常用作内参。上样对照通常
9、来自普遍表达的看家基因, 并且由于它们在不同范围的样品中特定的一致的表达水平而被广泛使用。 肌动蛋白 (-actin) 和甘油醛 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 是生物医学研究中最常用的 2 种内参对照, 然而越来越多的研究表明它们在动物和实验模型中的表达存在差异4,8-11。已有研究表明, 在运动神经元病症脊髓性肌萎缩 (SMA) 的小鼠模型的病理学影响的组织中, -actin 和 -tublin 差异表达12-13。该研究使用建立的严重 SMA 的小鼠模型, 从中得到脊髓组织, 来量化 -actin 和 -tublin 的蛋白表达水平。当使用 Western 印迹定量 (QWB) 来比较
10、SMA 小鼠受影响的脊髓与对照组织时, 发现了 -actin 和 -tublin 表达水平的改变。与对照组织相比, SMA 组织中的 -actin 和 -tublin 表达显著下调。该研究从一系列疾病模型的受累组织中可以检测到对照蛋白表达的显著改变, 鉴定了健康 (野生型) 组织中内参蛋白表达的差异性, 并且确定了在同一个体内不同组织中内参蛋白的表达同样存在差异。该实验使用 C57B1/6 (野生型) 小鼠的研究表明, 当比较同一小鼠的不同组织时, -actin 的表达显著不同。在心脏和脾脏组织之间观察到 -actin 蛋白表达的显著差异, 当比较这些组织时, 将数据归一化用于不同组织比较,
11、-actin 蛋白表达可以因此导致数据偏斜高达 22 倍。然而, 该实验同样证明了在某些组织如骨和脂肪之间的 -actin 表达存在同源性, 也就是说, 在这些组织中, 可以将 -actin 作为内参蛋白使用, 但也仅在这些特定的组织中能够使用。例如, 鱼类中实时荧光定量 PCR (q RT-PCR) 的研究与该研究的发现相一致, 该研究证明 -actin 在心脏、肌肉和脑的某些组织中不是理想的加样对照, 但其在肾脏和脾脏的表达结果一致, 可作为内参蛋白14。此外, 更进一步的研究表明在不对称组织中, -actin 等常作为加样对照的内参蛋白的表达量也是不均一的。例如, 在比较坐骨神经近端到远
12、端部分时, 相比之下, 神经丝 (NF-L) (神经元细胞骨架的主要组分) 的表达明显更高15, 接近 8 倍, 在坐骨神经的远端部分达到 4 倍 SEM。因此, 这些结果强调, 即使对单个动物的相同组织用于比较分析时, 解剖的准确性和一致性也是至关重要的。此外, 有研究证明内参蛋白在不同组织或在暴露于感染因子后表达量也不同14。因此, 根据内参蛋白定量产生的数据可能导致错误的结果。1.2 总蛋白定量是一种测定蛋白上样量的精确方法在选择 QWB 内参过程中需要考虑几个重要的变量因素, 包括敏感度的线性范围、不同组织或同一组织中蛋白质的表达量差异等。为了确定 QWB 实验中总蛋白分析法是否是一种
13、精确、可靠的检测蛋白上样量方法, 有研究者用牛血清白蛋白 (BSA) 经梯度稀释法建立了蛋白标准品, 并以此评估检测灵敏度1。BSA 的相对分子质量为 66 500, 在该处可以检测到线性荧光条带, 并且在很大的浓度范围内都存在良好的线性关系, 与其 0.998 的变异系数一致。重要的是, BSA 标准品溶液有效证明了信号条带的强弱很好地代表了蛋白质上样量的变化。这不仅证明了使用该方法检测蛋白质的良好线性关系, 也证明此方法中不存在通常出现于 ECL 蛋白检测法中的色彩饱和度问题。最终, 当应用 LICOR Odyssey 定量扫描系统检测真正的生物样品时, 在很大的蛋白浓度范围内检测蛋白质上
14、样量时总蛋白定量法 (使用考马斯亮蓝) 都有着优于内参蛋白 -actin 和 -tubulin 的良好线性 (140g) 。BCA 法和总蛋白定量法的变异系数分别为0.979 和 0.996, 表明这 2 种方法都具有良好的线性。此外, 在蛋白质溶液上样量的范围大至 140 mg 时, 总蛋白分析得出的数据仍与 BCA 法所得出的数据具有非常直接的相关性, 进一步说明总蛋白定量是一个非常可靠的蛋白质上样量对照。因此, 我们认为总蛋白定量提供了一种可避免单一蛋白对照所带来的各种问题的测定蛋白上样量的方法。总蛋白定量的优点如下: (1) 在来自不同模型的不同组织中, 它是稳定不变的; (2) 在不
15、同类型的组织中, 它是稳定的; (3) 在同一组织的不同部位中, 它是稳定的。总蛋白定量是 QWB 中一种简单的技术, 用来准确地确定在凝胶内是否已达到等同的蛋白质载量16。通过总蛋白定量获得的数据避免了用内参蛋白产生的误差。这并不意味着看家基因不能用做上样对照, 在明确掌握解剖结构和内参蛋白表达的情况下, 可以引用内参蛋白, 但是相比之下, 总蛋白定量应用的范围和精确度更广更好, 因此, 建议使用总蛋白定量以节省时间、资源, 增加灵敏度和准确度, 并且不必考虑将内参蛋白作为上样对照时的限制问题。因此, 总蛋白定量应被作为现代荧光定量Western 印迹中数据标准化的替代参考标准17。2 免染
16、技术基本概念2002 年, Analytical Biochemistry上的一篇文章中第一次提到免染技术 (stain free) 。免染技术主要包括 2 个部分, 即免染胶和 Chemi Doc MP 全能成像系统, 分析结果时需要 Image Lab 软件。免染胶与普通的预制胶不同, 免染胶包含特有的免染技术, 因此不能用预制胶代替。样品制备及电泳步骤与普通电泳一样。电泳后, 取出凝胶, 置于 Chemi Doc MP 全能成像系统中。通过电泳分离的蛋白经特定波长的紫外线 (UV) 照射而激活, 产生荧光, 从而被 CCD照相机捕获, 12 min 即能显示总蛋白条带, Image Lab 软件根据蛋白 marker自动估算各条带的相对分子质量和数量。2.1 免染技术原理免染技术利用可以在预制胶内使用的化学物质, 在凝胶制剂中掺入
