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1、说 明 书 摘 要1本发明涉及一组 PCR 特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组 PCR 特异性鉴别引物的核苷酸序列分别为 CL-F：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3；CL-R ：5 GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。采用 PCR 特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法步骤为：1）提取待测样品的基因组 DNA；2）以步骤 1）中提取的基因组 DNA 为模板，使用特异性 PCR 鉴别引物对其进行 PCR 扩增；3）对步骤 2）的扩增产物进行电泳检测，在 130bp 处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在 130bp 处未检测出条
2、带的待鉴定样品为其他植物材料。本发明只需要进行 PCR，然后取 PCR 产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。摘 要 附 图1权 利 要 求 书11一组 PCR 特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组 PCR 特异性鉴别引物为：CL-F ：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3；CL-R：5GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。2根据权利要求 1 所述的一组 PCR 特异性鉴别引物，其特征在于：其构建的具体步骤为：1）提取滇重楼及其混淆品的基因组 DNA；2）以步骤
3、1）提取的基因组 DNA 为模板，使用通用引物 ITS2 对其进行 PCR扩增；3）对步骤 2）的 PCR 扩增产物进行测序；4）使用 BioEdit 软件对步骤 3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；5）利用 primer premier 5.0 软件设计一组特异性 PCR 鉴别引物。3根据权利要求 2 所述的一组 PCR 特异性鉴别引物，其特征在于：步骤 2）中，PCR 反应体系总体积为 25L，反应体系包括 20mM 10PCR Taq buffer（Mg2+plus） 、10mM dNTP、上下游引物各 10M、1U DNA Taq 聚合酶、1L DNA 模
4、板、ddH 2O 补足 25L。4根据权利要求 2 所述的一组 PCR 特异性鉴别引物，其特征在于：步骤 2）中，PCR 反应体系的热循环程序为：94 预变性 3min，94变性 30s，56退火 45s，72延伸 1min，72延伸 10min 35 个循环。5一种采用 PCR 特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：具体步骤为：1）提取待测样品的基因组 DNA；权 利 要 求 书22）以步骤 1）中提取的基因组 DNA 为模板，使用特异性 PCR 鉴别引物对其进行 PCR 扩增；3）对步骤 2）的扩增产物进行电泳检测，在 130bp 处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在 130bp
5、 处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。6根据权利要求 5 所述的一种采用 PCR 特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：步骤 2）中，特异性 PCR 反应体系的热循环程序为：94预变性3min，94 变性 30s，56退火 45s，72延伸 1min，72延伸 10min 35 个循环。说 明 书1一组 PCR 特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法技术领域本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组 PCR 特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。背景技术重楼属 (Paris L.) 是百合科多年生草本植物,中国植物志英文版中记载重楼属植物全世界约有 39 个物种, 主要分布在欧亚大陆
6、的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用, 其中滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)Hand.- Mazz.)及华重楼 P. polyphylla var. chinensis(Franch.) Hara. 收载于 2005 年版中国药典, 是云南白药等多种中药的重要原料之一。然而重楼植物分类复杂, 由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生滇重楼不能满足市场需求,更破坏了生态环境和滇重楼资源，寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼
7、植物鉴定，已有形态学、细胞学 (包括核型和染色体多态性) 和 RAPD、AFLP 等 DNA 分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而位点PCR 技术直接利用 DNA 序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。目前，运用 DNA 分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过 对滇重楼（P. polyphylla var. yunnanensis） 、南重楼（Paris vietnamensis）与华重楼（P. polyphylla var. chinensis）等 11 个物种，比较几种片段各序列扩增和测序效率、种内和种间变异(朱英
8、杰,陈士林,姚辉,谭睿,宋经元,罗焜,鲁静.重楼属药用植物 DNA 条形码鉴定研究J. 药学学报. 2010(03) )。也有学者采用扩增叶绿说 明 书2体 psbA-trnH 序列计算种内和种间遗传距离，构建邻接树( neighbor-joining tree) 进行滇重楼及其同属物种的鉴定(刘涛，赵英良，杨莹等.滇重楼的 psbA-trnH 条形码分子鉴定研究J.天然产物研究与开发，2015，27:758-762)。上述技术显示了 DNA 条形码在滇重楼药材真伪鉴别应用的可能性，本发明利用特异性位点 PCR 的技术，克服了传统鉴别方法中样品量大，主观性大等问题，将之和南重楼、长柱重楼、大理
9、重楼等进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。发明内容为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一组 PCR 特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，直接从 DNA 分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义，且操作简单、鉴别快速。为实现上述目的,本发明是通过如下技术方案实现的：一组 PCR 特异性鉴别引物为：CL-F：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3；CL-R：5GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。进一步地，一组 PCR 特异性鉴别引物的构建步骤为：1）提取滇重楼及其混淆品的基因组
10、DNA；2）以步骤 1）提取的基因组 DNA 为模板，使用通用引物 ITS2 对其进行PCR 扩增；3）对步骤 2）的 PCR 扩增产物进行测序；4）使用 BioEdit 软件对步骤 3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，说 明 书3找出滇重楼特有的变异位点；6）利用 primer premier 5.0 软件设计一组特异性 PCR 鉴别引物（CL-F，CL-R） 。进一步地，步骤 2）中，PCR 反应体系总体积为 25L，反应体系包括20mM 10PCR Taq buffer（Mg2+plus） 、10mM dNTP、上下游引物各10M、1U DNA Taq 聚合酶、1L DNA 模板、d
11、dH 2O 补足 25L。进一步地，步骤 2）中，PCR 反应体系的热循环程序为：94预变性3min，94 变性 30s， 56退火 45s，72延伸 1min，72延伸 10min 35 个循环。一种采用 PCR 特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，具体步骤为：1）提取待测样品的基因组 DNA；2）以步骤 1）中提取的基因组 DNA 为模板，使用特异性 PCR 鉴别引物对其进行 PCR 扩增；3）对步骤 2）的扩增产物进行电泳检测，在 130bp 处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在 130bp 处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。进一步地，步骤 2）中，特异性 PCR 反应体系的热循
12、环程序为：94预变性 3min，94 变性 30s，56退火 45s，72延伸 1min，72延伸 10min 35 个循环。本发明的有益效果：本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从 DNA 分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作为滇重楼及物种鉴定的局限，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义；本发明只需要进行 PCR，然后取 PCR 产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小说 明 书4及有无即可区分滇重其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势，非常有利于中药的快速
13、鉴别。附图说明图 1 为滇重楼及其混淆品总 DNA 的电泳检测图谱； 图 2 为滇重楼及其混淆品通用引物 ITS2 扩增的电泳检测图谱；图 3 为滇重楼及其混淆品鉴别引物的电泳检测图谱。图中，1.滇重楼 Paris polyphyllavar. yunnanensis (Franch) Hand. -Mazz ；2.毛重楼 Paris aireiLeveille ；3.多叶重楼 Paris polyphylla Smith in Rees ；4.七叶一枝花(长狭叶) Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara ；5.大理重楼 Paris dali
14、ensisH. Li & V. G. Soukup ；6.南重楼 Parisietnamensis (Takhtajan) H. L ；7.长柱重楼 Paris forrestii (Takht.) H. Li ；8.七叶一枝花 Paris polyphyllavar. chinensis (Franch.) Hara ；9.五指莲重楼 Paris axialis H. Li ；10.阴性对照。 具体实施方式引物设计提取滇重楼及其混淆品的基因组 DNA，选择通用引物 ITS2 对滇重楼和混淆品进行扩增，扩增后样品送至上海生工生物公司测序。滇重楼以及其伪品ITS2 片段测序所得结果使用 BioE
15、dit 软件进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点，发现滇重楼变异位点较多，190bp 处滇重楼为 A，七叶一枝花-长狭叶为 T，而其他混淆品为 C，203bp 处为 C，而其他混淆品均为T，206bp 处滇重楼为 G，而其他混淆品均为 C，275bp 处滇重楼为 A，而其他混淆品均为 C，276bp 处滇重楼为 G，而其他混淆品均为 C，320bp 处滇重楼为A，而其他混淆品均为 G，331bp 处滇重楼为 T，而其他混淆品均为 C，363bp处滇重楼为 T，而其他混淆品均为 C，389bp 处滇重楼为 T，而其他混淆品均为说 明 书5C， 391bp 处滇重楼为 T，而其他混淆
16、品均为 C，利用 primer premier 5.0 软件，选择 203bp 和 331bp 处的位点设计 1 对特异性 PCR 引物（CL-F,CL-R） ，其核酸序列分别如下：ITS2F：5 ATGCGATACTTGGTGTGAAT3ITS3R：5GACGCTTCTCCAGACTACAAT3CL-F:：5CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC3CL-R：5GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC3。实施例1）材料、试剂与仪器a.材料材料如下表 1 所示，分别为滇重楼、毛重楼、多叶重楼、七叶一枝花-长狭叶、大理重楼、南重楼、长柱重楼、七叶一枝花和五指莲重楼。表 1 样品来源表中文名称 拉丁学名 收集地收集时间滇重楼 Parispolyphyllavar. yunnanensis (Franch) Ha
