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1、力达霉素对人宫颈癌 Caski 细胞增殖的影响及其机制 鲁华 秦烨 占景琼 王艳林 三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室 摘 要： 目的 探讨力达霉素对人宫颈癌 Caski 细胞增殖的影响及其可能的机制。方法 将对数生长期的人宫颈癌 Caski 细胞随机分为低、中、高浓度组及对照组, 低、中、高浓度组均加入含力达霉素的 RPMI 1640 完全培养基 100L, 分别调整其终浓度为 1、2.5、5 ng/m L, 对照组仅加入等体积 RPMI 1640 完全培养基。作用 24 h, 采用 MTT 法检测细胞增殖能力 (以吸光度值表示) , 计算细胞生存率;采用流式细胞术检测细胞周期及线
2、粒体膜电位降低比例;透射电子显微镜下观察细胞形态学改变, 计算细胞凋亡率及裂亡率。结果 低、中、高浓度组细胞增殖能力及细胞生存率均低于对照组, 且高浓度组降低更明显 (P 均0.05) 。2.4 各组细胞形态学变化对照组细胞膜完整, 向外形成大量纤细突起的微绒毛;细胞质染色正常, 可见线状、长杆状线粒体;细胞核常染色质 (低电子密度) 、异染色质 (高电子密度) 分布均匀。低、中、高浓度组存在多种形态的死亡细胞, 包括凋亡、坏死、裂亡的细胞。死亡细胞的主要特点: (1) 凋亡中期细胞体积变小, 细胞核深染, 异染色质边集, 核膜和细胞质膜完整, 细胞质内可见空泡形成, 细胞膜上可见以发芽、起泡
3、等方式形成的多个球形突起。凋亡晚期细胞体积进一步变小, 细胞质少而深, 细胞体周围可见多个球形突起脱落形成的一些大小不等的凋亡小体。 (2) 坏死早期细胞核染色质边集, 核中部电子密度低;细胞质结构崩解, 呈颗粒状;线粒体、内质网崩解形成空泡状结构, 可见其中含有中等电子密度的无定形电子致密物。坏死晚期细胞膜破裂, 细胞质逸出;细胞微绒毛消失, 细胞质结构崩解, 呈疏松颗粒状;细胞器崩解空泡形成, 染色质变淡呈颗粒状凝集, 只可见到细胞核轮廓。 (3) 裂亡早期细胞体积变大, 细胞有丝分裂异常形成大小不等多个细胞核。裂亡晚期细胞体积进一步变大, 细胞表面光滑, 微绒毛消失, 细胞质内充满线粒体
4、, 内质网肿胀崩解形成的空泡状结构;细胞核常染色质与异染色质差异消失, 呈砂砾样改变。2.5 各组细胞凋亡率及裂亡率比较对照组及高、低、中浓度组细胞凋亡率依次升高, 对照组及低、中、高浓度组细胞裂亡率依次升高, 两组间比较 P0.05 或0.01。见表 3。表 3 各组细胞凋亡率及裂亡率比较 (%, s) 下载原表 3 讨论力达霉素是一种新型抗肿瘤药物, 其对肝癌 BEL-7402 细胞 DNA、RNA 合成具有强烈的抑制作用7, 对结肠癌 HCT-116 细胞具有明显的细胞周期阻滞作用 (阻滞于 G2/M 期) 8, 并能显著诱导早幼粒白血病 HL-60 细胞、胰腺癌细胞、骨髓瘤 U266
5、及 SKO-007 细胞凋亡, 引起肝癌 BEL-7420 细胞发生裂亡12。本研究结果显示, 低、中、高浓度组细胞增殖能力及细胞生存率均低于对照组, 且高浓度组降低更明显;说明低浓度力达霉素处理 24 h 即能显著抑制人宫颈癌Caski 细胞增殖, 且该作用具有浓度依赖性。线粒体膜电位是指生物膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差, 可反映线粒体功能的完整性, 是评价线粒体功能的敏感指标13。细胞死亡方式有凋亡和裂亡等不同形式14,15, 细胞凋亡时线粒体损伤发生在细胞核凋亡特征 (染色质浓缩、DNA 断裂) 出现之前16。在凋亡因子的刺激下, 线粒体膜通透性转化孔增大, 使内膜离子浓度梯度消
6、失、呼吸链失偶联, 导致跨膜电位降低或耗散, 促进凋亡活性物质如 Cytc 等从线粒体基质中释放进入细胞质, 激活Caspase 级联反应, 最终引发细胞凋亡17。因此, 线粒体膜电位降低是细胞凋亡早期的一个标志性事件, 线粒体膜电位降低细胞比例可反映细胞凋亡的程度16。本研究结果显示, 低、中、高浓度组线粒体膜电位降低的细胞比例均高于对照组, 提示不同浓度的力达霉素均可导致线粒体膜电位显著下降, 并诱导细胞发生线粒体介导的凋亡。本研究中高浓度组细胞线粒体膜电位下降比例低于中、低浓度组, 细胞线粒体膜电位下降比例并没有随力达霉素浓度的升高而升高, 结合力达霉素对人宫颈癌 Caski 细胞的增殖
7、抑制作用呈浓度依赖性这一结果, 推测力达霉素除了诱导人宫颈癌 Caski 细胞凋亡外, 还可能诱导Caski 细胞发生其他类型的死亡。1989 年, Molz 等18发现在一种对热敏感的酵母突变株中, 细胞分裂时染色体分离发生异常。此后一些学者便把这种在 DNA 发生损害时, 细胞无法进行完全分裂而导致出现四倍体或多倍体的现象称为细胞有丝分裂灾变, 这种有别于典型细胞凋亡特征的细胞死亡方式也被称为裂亡19。裂亡的发生可能与细胞有丝分裂的异常, 如中心体过度复制、多极性纺锤体形成、多核形成等有关20, 细胞周期检测表现为 S 期和 G2/M 期阻滞21。本研究结果显示, 中、高浓度组G0/G1期
8、细胞比例均低于对照组及低浓度组, G 2/M 期细胞比例均高于对照组及低浓度组, 对照组及中浓度组 S 期细胞比例均高于低、高浓度组。说明力达霉素除了诱导人宫颈癌 Caski 细胞凋亡外, 还可诱导细胞发生裂亡。除了生化特征外, 裂亡与凋亡细胞还具有各自不同的形态学特征。凋亡细胞染色质凝集、边缘化, 细胞体皱缩、变圆, 形成凋亡小体;裂亡的主要形态学特征包括有丝分裂异常, 细胞体积变大, 形成多核细胞。本研究透射电镜观察结果证实, 力达霉素处理后的人宫颈癌 Caski 细胞形态学上发生上述凋亡、坏死及裂亡病理改变。本研究结果显示, 对照组及高、低、中浓度组细胞凋亡率依次升高, 对照组及低、中、
9、高浓度组细胞裂亡率依次升高;说明力达霉素浓度为2.5 ng/m L 时对细胞凋亡的诱导作用最强, 浓度为 5 ng/m L 时对细胞裂亡的诱导作用最强。上述结果提示, 不同浓度力达霉素诱导人宫颈癌 Caski 细胞死亡的模式也有所不同。综上所述, 力达霉素可抑制人宫颈癌 Caski 细胞增殖, 并呈浓度依赖性;其机制可能与诱导人宫颈癌 Caski 细胞凋亡或裂亡有关。参考文献1Hu JL, Xue YC, Xie MY, et al.A new macromolecular antitumor antibiotic, C1027.I.Discovery, taxonomy of produci
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