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1、8 种 子 生 活 力 测 定Z1 概述种子生活力（Seed viability）是指种子发芽的潜在能力。种子生活力测定在农业生产上具有重要的意义：测定休眠种子的生活力。许多植物种子因存在休眠，暂时不能萌发，因此发芽率很低，尤其是新收获的和野生性较强的种子，必须进行生活力测定，才能了解种子的发芽潜力，以便合理利用种子。播种前对发芽率低而生活力高的种子，应进行适当处理。种子检验时，若发芽试验末期有新鲜不发芽种子或硬实种子，也应接着进行生活力测定，以正确评定种子品质。快速预测种子的发芽力。休眠种子可借助于各种处理措施打破休眠，然后进行发芽试验，但所需时间较长。而种子贸易中，有时因时间紧迫，不可能采
2、用标准发芽试验来测定发芽力，因为发芽试验所需时间更长，如小麦需 8d，水稻需 14d，某些蔬菜和牧草种子需 23 周，而多数林木种子则需要更长的时间。在这种情况下，可用生物化学速测法测定种子生活力作为参考。种子生活力测定方法有 10 多种，根据其测定原理可大致分为 4 类：生物化学法，如四唑测定法、溴麝香草酚蓝法、甲烯蓝法、中性红法和二硝基苯法等。组织化学法，如靛蓝染色法、红墨水染色法和软 x 射线造影法等。荧光分析法。离体胚测定法。本节主要介绍四唑测定法、离体胚测定法、染料染色法和软 x 射线造影法。 Z2 生活力测定方法一、测定原理有生活力的种子，其活细胞原生质膜具有选择透性，当种子浸入染
3、料后，染料大分子不能进入活细胞内，所以胚部等活组织不能被染料染色，而死的种胚细胞因原生质膜丧失选择吸收能力，故可被染料染色。二、测定方法（一）染色法1靛蓝染色法此法适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。所用试剂为靛蓝（或称靛蓝洋红），分子式为 C18H8O2N2（SO 5Na） 2，系蓝色粉剂，能缓慢溶于水。测定方法如下：(l) 种子预处理：将种子浸人 30水中，水稻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等种子须先去壳再浸种，浸种时间因种子不同而异，小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为 3h，燕麦、芝麻等 4h，油菜、花生、棉籽等 6 h，蓖麻、红麻、大麻等 7 h、黍 8 h、水稻 1
4、2 h、玉米 20 h 将充分吸胀的种子 (100 粒 2 次重复），沿胚中线纵切（如禾谷类）或剥去种皮（如双子叶种子），以备染色用。 (2) 靛蓝染色：将处理好的种子置于培养皿或小烧杯内，加入靛蓝溶液淹没种子，纵切种子，用 0.1溶液，剥去种皮种子用 0.2溶液。染色时间禾谷类为 15min，油菜、芝麻、红麻和大麻等 30 min，大豆、亚麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等 60 min 豌豆180 min（3）观察鉴定：取出染色后的种子，用清水冲洗后立即进行观察鉴定。凡种胚不染色或染成浅蓝色的、胚根尖端或少部分子叶染色的，为有生活力种子；凡种胚全部染成蓝色的，或胚根、胚轴、胚芽、子叶等大部分染
5、成蓝色的，为无生活力种子。2.红墨水染色法其测定原理、种子预处理方法以及染色时间等与靛蓝染色法基本相同，只是所染成的颜色不同，死胚染成红色，活种子胚不染色。测定时用刚开瓶的红墨水，加水稀释后使用，红墨水与水的比例：小麦、玉米、大豆和棉花等为 1：60，大麦以 1：120 为宜。到达规定染色时间后取出种子，用清水冲洗并立即观察鉴定。（二）其 他 方 法四唑测定法（一）四唑测定法概述1发展简史四唑测定法于 1942 年由德国 H.Lakon 教授发明，二战期间传入美国。IST A 于 1950 年成立四唑测定技术委员会，1953 年首次将四唑测定列入国际种子检验规程。1974 年，ISTA 四唑测
6、定技术委员会主席美国 R.P.Moor 教授，为发展和推进四唑测定技术的标准化，主持编写四唑测定手册，其后经过多次 ISTA 会议讨论修改，于 I984 年正式公布发行。该手册汇集了世界上最先进实用的种子四唑测定技术，以及 650 多个属和种的农作物、蔬菜、林木、牧草、药材和花卉种子的具体测定技术，堪称最具权威性的四唑测定参考。种子生活力四唑测定技术经过不断研究和完善，目前已在全世界广泛应用。2特点四唑测定具有原理可靠、简便快速、结果准确、不受休眠限制以及成本低廉等特点。该法比按细胞膜选择透比不同的染色方法更为可靠，所击仪器设备和物品较少，程序比较简单，一般 2 4 h 之内即能获得测定结果，
7、不论是休眠种子还是非休眠种子均适用。因此，该法是世界公认的最有效的种子生活力测定方法。3适用范围根据国际种子检验规程规定，四唑测定适用于下列范围：(1）测定休眠种子、收获后需马上播种的种子以及发芽缓慢的种子的发芽潜力。（2）测定发芽试验末期末发芽种子的生活力，特别是怀疑有休眠时。 (3) 测定种子收获或加工过程中的种子损伤（如热伤、机械损伤、化学伤害等）原因。（4）解决发芽试验中遇到的问题，查明不正常幼苗产生的原因和杀菌剂、种子包衣等处理的伤害。(5)查明种子贮藏期间劣变衰老程度，按染色图形分级，评定种子活力水平。(6)调种时时间紧迫，快速测定种子生活力。（二）四唑测定法的原理有生活力的种子活
8、细胞在呼吸过程中都会发生氧化还原反应。四唑溶液作为一种无色的指示剂，被种子活组织吸收后，参与活细胞的还原反应，从脱氢酶接受氢离子，在活细胞里产生红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲替。化学反应式如下：依据四唑染成的颜色和部位，即可区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。一般来说，单子叶植物种子的胚和糊粉层、双子叶植物种子的胚和部分双子叶植物的胚乳、裸子植物种子的胚和配子体等属于活组织，含有脱氢酶，四唑渗入后能染成红色，而种皮和禾谷类胚乳等为死组织，不能染色。除完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，还可能出现一些部分染色的种子。判断种子有无生活力，主要看胚和（或）胚乳（或配子
9、体）不染色坏死组织的部位及面积大小，而不一定在于颜色的深浅，颜色的差异主要是将健全的、衰弱的和死亡的组织区别出来，根据上述原理鉴定种子胚的死亡部分，还可以查明种子死亡的原因。四唑染色是一酶促反应因此反应不仅受酶活性的影响，还受底物浓度、反应温度、pH 等因素的影响。该酶促反应的适宜 pH 为 6. 17，高于者低于此 pH 反应不能正常进行，也就无法测定种子活力的高低。因此对于游离酸含量高的四唑试剂应当用缓冲液配制。反应速率随温度的不同而变化温度每升高 10反应速率提高 1 倍，譬如 20 时需要反应时间 4h， 30则需要 2 h，但反应最高温度不能超过 45，染色时底物的浓度要一致，一般染
10、色部位切开的种子，测定时四唑溶液的质量浓度为 0.10.2 ，染色部位完整的种子，质量浓度为 1%2% 。种子预措时采用的方法应根据种子的化学组成和种子结构确定。（三）四唑测定法应用的化学试剂1 四唑四盐类有多种，最常用的是 2,3,5 一氯化（或溴化）三苯基四氮唑，英文名为 2 ,3 , 5 - triphenyl tetralium chloride (or bromide) TTC(TTB)或 TZ.分子式为 C 19H15 N4Cl，相对分子量 334.8 亦称红四唑，为白色或淡黄色粉剂，溶点 243，当达到约245就会分解，易溶于水，有微毒，试剂在光下会被还原成粉红色，因此需用棕色瓶
11、盛装，且瓶外要裹一层黑纸。同样配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里，存放在暗处，种子染色也需在暗处和弱光处进行。1996 版国际种子检验规程规定，正常使用四唑溶液质量浓度为 10，但有些情况下，可使用较低或较高的浓度。GB/T3543.7 一 1995 规定，四唑染色通常使用质量浓度为 0.11.0%的四唑溶液，一般来说，切开胚的种子可用 01 05的四唑溶液；整个胚、整粒种子或斜切、横切或穿刺的种子需用 10 的四唑溶液。四唑溶液的 pH 要求在 6.57.5 范围之内，若溶液的 pH 不在此范围时，建议采用磷酸缓冲液来配制。其配制方法为称取 1 g 四唑粉剂溶解于 100 ml 磷酸缓冲液中，即
12、配成1.0%（或 0.1%）的四唑溶液。当用酸度计测定时，若四唑溶液的 pH 达不到要求，则可用 NaOH或 NaHCO3 稀溶液加以调节。配好的四唑溶液应保存在棕色瓶中，一般有效期为几个月，如存放在冰箱，则有效期更长。已用过的四唑溶液不能再用。2磷酸缓冲液为保证配制的四唑溶液 pH 在 6.5 7.5 范围内，通常采用磷酸缓冲液来溶解粉剂。磷酸缓冲液的配制方法有两种， (1) ISTA 规程法：先准备两种溶液。溶液 I在 1000ml 蒸馏水中溶解 9.078g KH2PO4。溶液 在 1 000ml 蒸馏水中溶解 9.472 g Na2HPO4 或 11.876 g Na2HPO42H2O
13、然后取溶液 I 2 份和溶液 I I 3 份混合即成。（2）AOSA 规程法：在 1000ml 蒸馏水中溶解 5.45 g N aH2PO4 和 3.79 g Na2HPO4。3乳酸苯酚透明液用于染色后的小粒豆类和牧草种子，使种皮、稃壳或胚乳变得透明，以便清楚地观察鉴定。其配法为：20ml 乳酸+20ml 苯酚+40ml 甘油20ml 蒸馏水。4过氧化氢溶液用于某些牧草种子（如黑麦草、早熟禾、羊茅和鸭茅等）的预湿浸种，以加快吸胀和酶的活化。一般应用 0.3%H2O 溶液。5杀菌剂和抗生素 用微量的杀真菌剂和（或）抗生素加入四溶液或染色样品中，以延缓衰弱种子的劣变进程。可应用 0.5%青毒素等抗
14、生素6.胶液硬化剂有些种子浸种后，种皮表面出现胶黏物质而变得非常光滑难以进行样品准备，可用 AIK(SO4)212H2O, K2SO4,A12(SO4)3 等硬化剂处理。如将种子浸在 12%AIK(SO 4)212H2O 溶液中 5min,可有效地减少胶黏物质。（四）四唑测定法的程序参照 1996 版国际种子检验规程的规定介绍四测定法的程序：1.试验样品从净度分析后并经充分混合的净种子中，随机数取 100 粒种子，4 次重复。如果是测定发芽试验末期休眠种子的生活力，则单用发芽试验末期所发现的休眠种子。2.染色前的种子准备(1)种子的预湿：预湿是四唑测定的必要步骤。因为吸胀种子一般比干种子不易破
15、碎并且比较容易切开或刺穿。此外，预湿使活组织酶系统活化，可提高染色的均匀度、深度、鉴定的可靠性和正确性。有些种子在预湿前还要进行预措处理，以利吸胀，如水稻种子需脱去秤壳，豆科硬实种子需刺破种皮等，但须注意，预措不能损伤种子内部胚的主要构造。如果利用较高或较低温度进行预湿，则相应调整预湿时间，并将所采用的时间和温度填报在种子检验证书上。预湿方法有以下两种：缓慢预湿：按发芽试验所用的方法，将种子放在纸上或纸间吸湿。该法适用于那些直接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以及已经劣变的种子或过分干燥的种子。有些种子，缓慢预湿达不到充分吸胀，有必要进一步在水中浸一段时间。水浸预湿：将种子完全浸在水中，让其达到
16、充分吸胀。如果浸渍时间超过 24h，则应换水。部分植物种子在 20下的预湿方式和最少预湿时间见表 5 一 I，表 5 一 2。(2)染色前的种子处理：许多植物的种类（表 5 一 l，表 5 一 2）在染色前需将其胚的主要构造和活的营养组织暴露出来，以利于四唑溶液渗透便于正确鉴定。可采用下列处理技术刺穿、切开种子或剥去种皮。其刺、切方法见图 5 一 1。处理后的种子应保持湿润直到每个重复都完成为止。 刺穿：对经过预湿的种子或硬实种子，可利用解剖针或解剖刀，刺穿种子的非主要部位。纵切：所有禾谷类和禾本科牧草种子，像羊茅属大小种子或较大的种子，通过胚中轴的中部纵向切开，约达胚乳长度的 3/4；无胚乳而具有直立胚的双子叶植物种子
