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1、基金项目：科技基础性工作专项重点项目子课题（SB2007FY020） ；甘肃教育厅科研项目(1106B-07)；甘肃中医学院中青年科研基金项目(ZQ2011-12)；作者简介：朱田田（1983） ，女，汉族，甘肃金昌人，讲师，在读硕士，研究方向：中药资源开发与质量综合评价。通讯作者简介：晋玲（1974） ，女，汉族，陕西韩城人，副教授，博士，研究方向：珍惜濒危和大宗常用中药资源可持续利用。不同方法提取中麻黄基因组 DNA 的比较研究朱田田 1，2 ，晋玲 1，2* ，杜弢 1，2 ，陈红刚 1,2，张延红 1,2，王惠珍 1,2，王艳 1,2（1.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2.
2、甘肃省高校中（藏）药化学质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000）摘 要：目的 比较不同 DNA 提取方法，选择最适于中麻黄基因组的方法，为其后续分子生物学实验奠定基础。方法 采用改良 CTAB 法、SDS 法、试剂盒法提取中麻黄基因组 DNA；用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测所得总 DNA 的得率和纯度，并进行 ISSR-PCR 扩增检测。结果 3 种方法均可从新鲜中麻黄中提取出产量较高的基因组 DNA,但其中改良 CTAB 法提取的总 DNA 纯度高，质量好，扩增产物的电泳条带也较明显；SDS 法和试剂盒法提取的总 DNA 质量差，不适用于下游分子生物学实验。结论 改良 CT
3、AB 法为中麻黄基因组 DNA 提取的最佳方法，该方法提取的基因组 DNA 适用于中麻黄基因组 PCR 扩增和其他分子生物学研究。关键词:中麻黄；DNA 提取；CTAB 法 The Comparative Study of Different Methods for Extraction of Genomic DNA from Ephedra intermediaZHU Tian-tian1，2 , JIN Ling1，2 *,DU Tao1，2 ,CHEN Hong-gang1，2 ,ZHANG Yan-hong1，2 , WANG Hui-zhen1，2 , WANG Yan1，2（1.
4、Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou, 730000；2. Key laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province，Lanzhou，730000 ）Abstract: Objective By comparing different extraction methods of genomic DNA,the best extraction method of Ephe
5、dra intermedia genomic DNA was selected, which can be obtained for later molecular research. Method Improved CTAB method, SDS method，kit method was used for the extraction of genomic DNA from Ephedra intermedia；The yield and purity of total genomic DNA were examined by agarose gel electrophoresis,UV
6、-spectrophotomoter and ISSR-PCR. Result Three extraction methods could extracted the high amount genomic DNA from fresh tissue of Ephedra intermediaImproved CTAB method could yielded highest purity total DNA, and the electrophoretic bands of amplified products were obvious；On the other sides, SDS me
7、thod and kit method indicated low purity of the yielded DNA and could not be used in downstream application directly. Conclusion The improved CTAB method is the best of the three compared methods for extracting the genomic DNA from Ephedra intermedia，which is suitable for PCR reaction and other mole
8、cular research in Ephedra intermedia genomic DNA.Key words: Ephedra intermedia；DNA extraction；CTAB methed麻黄（Herbal Ephedrae） 是 中 医 临 床 常 用 中 药 , 具有发汗解表，宣肺平喘等功效 。被中华人民共和国药典收录的麻黄属植物只有 3 个种，其中的中麻黄（ Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey ） 在甘肃省分布最广，品质优良。因近年来国内外对麻黄碱需求量的猛增，使人们对我省中麻黄进行掠夺式采挖，导致目前其天然资源已遭严重破坏，
9、因此甘肃省中麻黄资源可持续性利用和保护工作势在必行 1-4 。近年来，分子生物技术已在药用植物资源利用与保护方面得到广泛应用，而进行任何分子生物学研究的首要环节都是提取高质量的基因组 DNA。本试验以中麻黄新鲜草质茎为材料，采用三种方法提取其基因组 DNA，以期从中找出提取中麻黄基因组 DNA 的最适方法，为进一步开展中麻黄分子生物学研究奠定基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 植物材料：中麻黄 （ E.intermedia） 。采自甘肃省兰州市仁寿山，选取无病虫害的幼嫩地上茎，剪成小段置于液氮罐中带回实验室，于-20冰箱中保存备用。全部样品由甘肃中医学院中药资源教研室晋玲博士鉴定。1.
10、1.2 仪器设备：台式高速冷冻离心机(TGL16M)；数显恒温水浴锅(HH-S 24)；电泳仪(DYY-7)；电泳槽(北京六一仪器厂)；PCR 扩增仪（Biometra） ；紫外分光光度计(UV-1102)；凝胶成像系统 (Bio-Rad)；涡旋混合仪（WH-3）等。1.1.3 主要试剂：CTAB、EDTA、SDS、Tris、PVP、-巯基乙醇购于西安科昊生物工程有限责任公司；RNaseA、琼脂糖（Agarose） 、EB、PCR 相关试剂为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；柱式植物基因组 DNAout（北京天恩泽基因科技有限公司） ；其余试剂均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 基因组
11、 DNA 的提取（1）改良 CTAB 法：本研究根据试验材料特点并参照其他学者的研究结果 8-11 ，在常规 CTAB 法 5-7 基础上加以改进，具体操作骤如下：称取 0.1g 左右植物组织（两个重复）置于洁净干燥研钵中，加入适量 PVP，与液氮共研成细粉后迅速转入 2m l 离心管中；加入 800l 65预热的 CTAB 提取缓冲液(2CTAB, 20mmol/L EDTA(pH8.0), 100mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ,1.4mol/L NaCl, 2-巯基乙醇)，充分混匀，放入 65水浴温育 50min，期间每隔 15min 颠倒混匀一次；冷却至室温后加入等体积氯
12、仿/异戊醇的（24：1） ，轻轻颠倒混匀后静置 5min，120000r/min离心 10min，用切尖枪头仔细吸取上层水相于新离心管中，重复此步骤 23 次，直到分界层无白色沉淀为止；取上层水相放入新的离心管中, 加入 4l RNaseA（10mg/mL） ，37温浴 1h；加入 2/3 体积的异丙醇， 1/10 体积的 5mol/L 乙酸钠轻轻混匀，于-20放置 30 min,沉淀 DNA；120000r/min 离心 10min，小心倒掉上清液，保留 DNA 沉淀于管底，加入 70乙醇 700l洗涤沉淀 23 次；室温干燥后加入 130l TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀并保存于 4冰箱中
13、备用 (-20长期保存)。（2）SDS 法：称取 0.1g 左右植物组织（两个重复）置于洁净干燥研钵中并加入适量 PVP，与液氮共研成细粉后迅速转入 2ml 离心管中；加入 800l 65预热的SDS 提取缓冲液(10SDS, 100mmol/L EDTA(pH8.0), 50mmol/L Tris-HCl(pH8.0) ,100mmol/L NaCl, 2-巯基乙醇)和 4l RNaseA（10mg/mL） ，充分混匀后放于65水浴中温育 20min，其间颠倒混匀样品 23 次；加入 250l 5mol/L KAc，混匀后置冰上 30 min；4、120000r/min 离心 10min，用
14、切尖枪头小心转移上清液于 M 1.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 M新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，120000r/min 离心5min，重复此步骤 12 次；取上清液，加入 0.7 倍体积预冷异丙醇，混匀，-20沉淀 30 min，120000r/min 离心 5min，在管底可以见到白色的 DNA 沉淀块，倒弃上清液；加 1ml 70乙醇洗涤 DNA 沉淀 23 次，室温干燥 DNA 后加入 130l TE缓冲液溶解 DNA，保存于 4冰箱中备用 (-20长期保存)。（3）柱式植物基因组 DNAout 试剂盒法：首先调整植物组织称取量与前两种方法相同
15、，在与液氮研磨时加入适量 PVP，然后步骤按试剂盒说明书进行。1.2.2 电泳检测 DNA 的完整性 取 5l DNA 样品与 1l上样缓冲液混匀后点样于0.8琼脂糖凝胶孔，电泳缓解液为 1TBE 溶液，电压 80V 下电泳 1h 左右，EB(溴化乙锭)染色，用凝胶成像系统照相，保存。1.2.3 紫外分光光度法检测 DNA 的纯度和浓度 取 20l基因组 DNA 样品用 TE 缓冲液稀释 20 倍，混合均匀后加入石英比色皿中，测定在 260nm 和 280 nm 波长处的紫外吸收值。根据 A260/A280 的比值判断总 DNA 纯度，并计算其浓度（DNA 浓度=A260*稀释倍数*50g/m
16、l ） 。1.2.4 PCR 扩增检测 以提取的基因组 DNA 为模板，选取引物 810 进行 ISSR-PCR扩增。20l 反应体系中含 10PCR Buffer(Mg2+ Plus)1.5l, TaqDNA 聚合酶 0.75U, 引物 0.4mol/L, dNTP 0.25mmol/L, DNA 模板 20 ng/l 。扩增程序为 94预变性4min，94变性 45 S，50退火 45S,72延伸 2min，40 个循环，72延伸7min,4保存结束反应。扩增产物在 12的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照。2 结果与分析2.1 基因组 DNA 电泳检测结果三种方法提取的基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1 所示。2000bp2000bp注：1.1-1.2 改良 CTAB 法；2.1-2.2 SDS 法；3.1-3.2 试剂盒法；
