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1、1高铁饮食致 C57BL/6 小鼠黑质 DA 多巴胺能神经元选择性损伤的研究作者：吕占云 姜宏 徐华敏 谢俊霞 【摘要 】 目的 研究高铁饮食对 C57BL/6 小鼠黑质(SN) 和中脑腹侧被盖区(VTA)多巴胺能神经元的不同损伤。方法 将 C57BL/6 小鼠随机分为高铁饮食组和正常对照组，利用免疫组织化学染色法及铁染色技术检测两组小鼠 SN 和 VTA 的酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数及铁水平的变化。结果 高铁饮食组 SN 的 TH 阳性细胞数较正常对照组明显减少(t=16.31，P0.001)，铁染色阳性细胞数较对照组明显增高(t=13.01,P0.001)。而两组小鼠 VTA 的 TH
2、 阳性细胞数及铁染色阳性细胞数均无明显差别。结论 铁在 SN 的选择性聚积参与了 SN 多巴胺能神经元的选择性损伤。 【关键词】 铁;黑质;腹侧被盖区;神经元;创伤和损伤;酪氨酸单氧化酶; 小鼠ABSTRACT Objective To investigate the effect of ferric diet on the degeneration of dopaminergic neurons between 2the substantia nigra (SN) and the ventral tegmental area (VTA) in C57BL/6 mice. Methods Th
3、e male C57BL/6 mice were randomly divided into two groups: ferricdiet group and normaldiet group. Tyrosine hydroxylase (TH) positive cells and iron positive cells in SN and VTA were determined using immunohistochemistry and iron staining. Results Compared with those of the control group, the number
4、of THpositive cells in SN was significantly decreased (t=16.31,P0.001) and the number of ironpositive cells significantly increased (t=13.01,P0.001) in ferricdiet group. The numbers of both THpositive cells and ironpositive cells were not significantly different in the VTA between the two groups. Co
5、nclusion Selective iron accumulation in SN is involved in the selective degeneration of dopamine neurons in SN.KEY WORDS lron; substantia nigra; ventral tegmental area; neurons; wound and injury; tyrosine 3monooxygenase; mice帕金森病(PD)是一种多发于中老年人群的中枢神经系统退行性疾病，其典型的病理特征为黑质(SN)多巴胺能神经元缺失。中枢神经系统内有两条主要的多巴胺能通
6、路：一条自 SN 投射到纹状体;3另一条为代谢通路，起自中脑腹侧被盖区(VTA)，终止于伏核以及其他的边缘系统。PD 病人多巴胺能神经元的退行性变化主要发生在SN，而 VTA 却极少累及1。这一现象在各种实验动物模型上也得到了证实，例如 6羟基多巴胺(6OHDA) 处理的大鼠模型、1 甲基4 苯基1 ，2，3，6 四氢吡啶(MPTP)处理的小鼠模型以及鱼藤酮处理的灵长类动物模型等2。其机制可能与不同多巴胺能神经通路对氧化应激的反应不同，以及其脑源性神经营养因子(BDNF)基因的表达不同有关2。但其确切机制仍然不是十分清楚。本实验采用高铁饮食饲养小鼠方法，观察了 SN 和 VTA 的酪氨酸羟化酶
7、(TH)和铁水平的变化，以探讨 SN 多巴胺能神经元的选择性损伤及其机制。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物 C57BL/6 雄性小鼠 16 只,15 17 d 龄，由北京维通利华实验动物中心提供。1.1.2 试剂 右旋糖酐铁 (美国 Sigma 公司) 、鼠抗兔 TH 抗体(美国 Sigma 公司)、免疫组化试剂盒及 DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)，其余试剂购自本地代理商。41.2 方法1.2.1 实验动物模型的建立 将 16 只小鼠编号后根据随机数字表随机分为 2 组，每组 8 只。高铁饮食组每日给予含质量分数0.025 的右旋糖酐铁饮食，自由取食至出生后
8、2 个月;正常对照组每日正常饮食至出生后 2 个月。1.2.2 组织准备 用 80 g/L 水合氯醛按 4 mL/kg 腹腔注射麻醉动物，灌注固定取材，脑组织采用 40 g/L 多聚甲醛固定 24 h，然后置 200 g/L 蔗糖冷冻保护溶液中，待脑组织沉底后再移入 300 g/L 蔗糖冷冻保护溶液中，行连续冠状冰冻切片，片厚为 16 m，载玻片预先用多聚赖氨酸处理，烤箱烤干后保存。1.2.3 免疫组织化学染色 切片在空气中放置至室温后，用0.01 mol/L 的磷酸缓冲盐溶液 (PBS)冲洗 3 次，浸泡在体积分数为0.01 的 H2O2甲醇溶液中孵育 30 min 以除去内源性过氧化物酶。
9、PBS 冲洗 3 次后用体积分数 0.015 正常山羊血清 37 封闭 30 min，用 TH 抗体(15 000)孵育，并置于湿盒中于 4 冰箱内过夜。PBS 冲洗后，用生物素化山羊抗鼠二抗工作液孵育 30 min，PBS冲洗 3 次，用辣根酶标记的链酶卵白素工作液孵育 30 min，PBS冲洗 3 次，用 DAB 试剂盒显色 2 min，观察其反应。不加一抗的切5片不显色3。1.2.4 铁染色 组织切片处理同 TH 免疫组化染色，采用 PBS冲洗 3 次后，将切片置于等量体积分数 0.02 的盐酸和 20 g/L 亚铁氰化钾的混合液中孵育 30 min，PBS 冲洗后浸泡在体积分数为0.0
10、1 的 H2O2甲醇溶液中孵育 20 min 以除去内源性过氧化物酶，DAB 显色。1.3 统计学处理统计 SN 及 VTA 每个高倍视野(400 倍)内的阳性细胞数目并取平均值。实验结果以均数标准差表示。采用 PPMS 1.54软件进行统计学处理，两组之间均数的比较采用 t 检验。2 结 果2.1 免疫组化染色高铁饮食组、正常对照组小鼠 SN 内 TH 阳性细胞数分别为27.861.07、40.141.68，高铁饮食组较正常对照组明显减少(t=16.31,P0.05) 。见图 1。A、B：正常对照组 SN、VTA 400 倍视野 TH 阳性细胞数;C、D: 高铁饮食组 SN、VTA 400
11、倍视野 TH 阳性细胞数。图 1 两组 SN 和 VTA 内 TH 阳性细胞数的变化2.2 铁染色高铁饮食组、正常对照组 SN 内铁染色阳性细胞数分别为34.032.68、15.172.32，高铁饮食组较正常对照组明显增多(t=13.01,P0.05) 。3 讨 论PD 的病理学特征为 SN 多巴胺能神经元的选择性缺失及路易小体的形成。PD 病人多巴胺能神经元的退行性变化主要发生在SN，而 VTA 却极少累及1。本实验在高铁饮食动物模型上得到了一致的结果。高铁饮食动物 SN 内的 TH 阳性细胞数明显降低，而VTA 内 TH 阳性细胞数则未见明显变化，但 SN 多巴胺能神经元选择性损伤的机制仍
12、不是十分清楚。7已有文献报道，PD 病人的 SN 铁水平明显升高5 。一般认为，铁离子在多巴胺能神经元细胞内的损伤机制如下：多巴胺在单胺氧化酶 B(MAOB)的作用下产生 H2O2，Fe2+ 可与 H2O2 通过Fenton 反应, 生成具有高度细胞毒作用的OH(H2O2+Fe2+OH+ OH-+ Fe3+)6;OH可造成蛋白质、核酸和细胞膜的损伤, 从而造成细胞的死亡7。PD 的另一病理特征是路易小体的形成，而且 PD 病人死后尸体解剖也发现路易小体周围有铁环绕8，提示铁对 SN 多巴胺能神经元损伤可能与路易小体形成有关。路易小体的主要成分是 alphasynuclein，文献报道，alph
13、asynuclein在铁的存在下可以生成有毒性的不溶的聚集体9 。所以，铁也可能通过导致路易小体形成而导致 SN 多巴胺能神经元死亡。本室前期研究已显示，直接在大鼠 SN 内注射 FeCl3 可使损毁侧多巴胺释放量和含量均降低10。口服铁螯合剂可以抵抗铁导致的损伤作用11 。同时，在 MES23.5 细胞系上也证实了铁对多巴胺能神经元的损伤作用12。提示铁可能参与了 SN 多巴胺能神经元的选择性损伤。因此，本实验在高铁饮食动物模型上，观察了 SN和 VTA 的铁染色阳性细胞数。结果显示，给予高铁饮食后，SN 内铁水平明显增高，而 VTA 内铁水平未见明显变化，提示铁在 SN 的选择性聚积和 T
14、H 阳性细胞数减少间存在着相关性，SN 和 VTA 内8铁含量差异可能是导致 SN 和 VTA 多巴胺能神经元不同损伤的原因之一。【参考文献】1DAMIER P, HIRSCH E C, AGID Y, et al. The substantia nigra of the human brain. . Patterns of loss of dopaminecontaining neurons in Parkinsons diseaseJ. Brain, 1999,122(Pt 8):14371448.2GRANT R J, CLARKE P B. Susceptibility of asce
15、nding dopamine projections to 6hydroxydopamine in rats: effect of hypothermiaJ. Neuroscience, 2002,115:12811294.3李林静,姜宏 ,王俊,等. GHRELIN 对 MPTP 小鼠帕金森病模型黑质 TH、BCL2 和 BAX mRNA 表达的影响J. 青岛大学医学院学报, 2007,43(4):283285.4周晓彬,纪新强 ,徐莉. 医用统计学软件 PPMS 1.5 的组成和应用特点J. 齐鲁医学杂志， 2009,24(1):2932.5GRIFFITHS P D, DOBSON B R, JONES G R, et al. Iron in the basal ganglia in Parkinsons disease. An in vitro 9studyusing extended Xray absorption fine structure and cryoelectron microscopyJ. Brain, 1999,122:667673.
